2026, Vol. 43文章信息
- 金振辉, 皮林君, 谢智玖, 等.
- JIN Zhenhui, PI Linjun, XIE Zhijiu, et al.
- 补肾壮膝方治疗膝骨关节炎的作用机制研究
- Study on the mechanism of Bushen Zhuangxi Formula in the treatment of knee osteoarthritis
- 天津中医药, 2026, 43(10): 1315-1328
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2026, 43(10): 1315-1328
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2026.10.13
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文章历史
- 收稿日期: 2026-06-08
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2. 新疆医科大学中医学院，乌鲁木齐 830017
膝骨关节炎（KOA）是一种以关节软骨进行性退变为主要特征的慢性关节疾病，其发病机制复杂，涉及炎症、代谢、机械应力等多重因素[1]。中医学将KOA归属于“痹证”“骨痹”范畴，认为其根本病机为“本痿标痹”，即肝肾亏虚为本，风寒湿邪、痰瘀痹阻为标[2]。补肾壮膝方（Bushen Zhuangxi Formula）由酒牛膝、杜仲、肉苁蓉、黄芪、当归、白芍、川芎、木瓜8味中药组成，具有补益肝肾、温阳益气、养血活血、舒筋止痛的功效。该方源自首都国医名师王玉英教授的临床经验，王教授认为肾阳虚衰是KOA发病的关键环节，阳虚则寒凝，寒凝则血瘀，终致筋骨失养、关节痹痛。王教授以宋代陈言《三因极一病证方论》中的牛膝木瓜汤与苁蓉牛膝汤[3]为基础，联合加减化裁而成，不仅注重补肾壮阳、益精强骨，针对肾阳亏虚、筋骨失养之本虚状态，而且强调通经活络、舒筋止痛，针对膝关节痹阻、屈伸不利等局部病变，实现了“补肾强骨”与“通络止痛”的相互兼顾。补肾壮膝方临床用于肾阳虚型KOA疗效显著，但其药效物质基础及分子机制尚有待进一步阐明。
本研究运用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）技术对补肾壮膝方水煎液的化学成分进行全面分析，并通过网络药理学构建“成分-疾病-靶点”网络及蛋白质相互作用（PPI）网络，预测该方治疗KOA的潜在活性成分、治疗靶点及信号通路。最后，在肾阳虚型KOA大鼠模型中探究补肾壮膝方的抗炎和软骨保护作用机制，以期为临床使用补肾壮膝方治疗KOA提供依据。
1 材料和方法 1.1 质谱分析 1.1.1 仪器与试剂Waters H-Class超高效液相色谱仪（沃特世科技有限公司，型号Waters H-Class），AB Sciex Triple TOF® 4600高分辨质谱（SCIEX公司）。乙腈、甲醇、甲酸（质谱纯；批号分别为F205283、F327294、EB28514；CNW公司）。补肾壮膝方浸膏粉由北京中医药大学提供。
1.1.2 样品制备取酒牛膝0.54 kg、杜仲0.81 kg、管花肉苁蓉0.54 kg、黄芪0.27 kg、当归0.54 kg、白芍0.54 kg、川芎0.27 kg、木瓜0.54 kg，生药总计4.05 kg。将上述药材投入多功能提取罐中，加水提取2次，每次加12倍量水，保沸1.5 h，提取液经80目筛网过滤后弃去药渣；滤液进行真空浓缩（真空度-0.08~-0.03 MPa，温度≤95 ℃），浓缩至固形物含量45%~55%，得浓缩液2.09 kg（固形物42.02%）；将浓缩液降温至≤40 ℃，缓慢加入85%乙醇至乙醇浓度达60%，静置12 h以上，取上清液；上清液于真空浓缩器中回收乙醇，得醇沉浓缩液1.4 354 kg（固形物36.66%）；加入药材用量10%的β-环状糊精，加热搅拌至完全溶解，喷雾干燥至水分≤7.0%，得总质量0.8 kg浸膏粉，即4.05 kg生药制得0.8 kg浸膏粉，称取补肾壮膝方浸膏粉1 g，精密称定，置于离心管，加入50%甲醇10 mL，超声（功率300 W，频率40 kHz）处理30 min，取出，放冷，摇匀，高速离心（12 000 r/min，离心半径8.4 cm）5 min，取上清液即得。
1.1.3 色谱及质谱条件色谱柱为Agilent InfinityLab Poroshell 120 AQ-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 µm）；柱温35 ℃；流速0.3 mL/min；进样量2 µL；流动相A为乙腈，B为0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱程序为：0~3 min，3% A；3~7 min，3%→8% A；7~15 min，8%→ 15% A；15~24 min，15%→30% A；24~30 min，30%→ 44% A；30~34 min，44%→95% A；34~37 min，保持95% A；37~37.1 min，95%→3% A；37.1~40 min，保持3% A。质谱采用电喷雾离子源（ESI），负、正离子模式扫描，质量范围m/z 50-1 700。
1.1.4 成分鉴定通过天然产物高分辨质谱数据库（Natural Products HR-MS/MS Spectral Library 1.0）结合相关文献进行化合物鉴定。鉴定依据包括：保留时间、精确分子量（误差 < 5 ppm）、二级质谱碎片信息，并与数据库标准品图谱或文献报道数据比对确认。
1.2 网络药理学 1.2.1 补肾壮膝方有效成分靶点筛选根据质谱鉴定结果，通过PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取各成分的SMILES结构，导入Swiss Target Prediction平台（http://www.swisstargetprediction.ch/）预测靶点，筛选置信度评分 > 0的靶点。通过UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）校正基因名，获得补肾壮膝方的潜在作用靶点。
1.2.2 KOA疾病靶点筛选以“knee osteoarthritis（KOA）”为关键词，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和CTD数据库（https://ctdbase.org/）检索KOA相关靶点。在GeneCards数据库中选取Relevance score ≥ 10的靶点，NCBI和CTD数据库选取全部相关靶点，合并去重后得到疾病靶点库。
1.2.3 药物-疾病共有靶点及网络构建利用Venny 2.1平台获取补肾壮膝方成分靶点与KOA疾病靶点的交集，绘制韦恩图。使用Cytoscape 3.8.0软件构建“药物-成分-靶点”网络。
1.2.4 PPI网络构建及核心靶点筛选将共有靶点导入STRING数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl），设置物种为“Homo sapiens”，置信度阈值> 0.4（中等置信度），并隐藏网络中断开连接的孤立节点，构建PPI网络。利用Cytoscape软件的NetworkAnalyzer工具进行拓扑分析，计算节点的度值（Degree）、介数中心性（Betweenness）和紧密度（Closeness），按度值（Degree）排序筛选核心靶点。
1.2.5 GO和KEGG富集分析基于STRING数据库，使用R 4.0.3软件中的clusterProfiler包对共有靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，以校正后P < 0.05为阈值，筛选显著富集的条目和通路。
1.2.6 分子对接选取PPI网络中Degree值靠前的核心靶点（AKT1、RELA、TNF）与“药物-成分-靶点网络”中交集最多的主要化合物（黄芪甲苷、绿原酸、芍药苷、β-蜕皮甾酮）进行分子对接。从PubChem数据库获取化合物3D结构，经OpenBabel转换为Mol2格式；从PDB数据库下载靶点晶体结构（AKT1：2UVM，RELA：6NV2，TNF：2E7A）。利用PyMOL对蛋白去水、去配体，AutoDock Tools进行加氢、计算电荷，AutoDock Vina进行半柔性对接。
1.3 动物实验 1.3.1 实验动物选择健康SPF级雌性SD大鼠36只，8月龄，体质量（250±20）g，由北京中医药大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：SCXK（京）2024-0001。饲养条件：适应性喂养1周，自由摄食饮水，采用12 h明暗交替环境，温度控制在（22±2）℃，湿度50%~60%，氨浓度 < 15 mg/m3，噪音≤60 dB。所有实验操作均遵循实验动物伦理委员会相关规定，伦理编号：BUCM20260102-008。
1.3.2 药物及试剂补肾壮膝方由酒牛膝2g、杜仲3 g、肉苁蓉2 g、黄芪1 g、当归2 g、白芍2 g、川芎1 g、木瓜2 g组成，按文中“1.1.2”方法制备药材浸膏粉，临用前以蒸馏水配制。阳性对照药为独活寄生颗粒（批准文号：国药准字Z20050053；规格，每袋装5 g，生产厂家：海南海力制药有限公司）由独活、桑寄生、防风、秦艽、细辛、当归、白芍、川芎、熟地黄、党参、盐杜仲、川牛膝、茯苓、甘草、桂枝组成，辅料为蔗糖、糊精。
ELISA试剂盒[雌二醇（E2）、雌激素受体α（ERα）、Ⅱ型胶原蛋白（COLⅡ）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、性别决定区Y框蛋白9（SOX9）、Ⅱ型胶原羧基端端肽（CTX-Ⅱ）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、含血小板反应蛋白基序的解整合素金属蛋白酶5（ADAMTS-5）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）]购自上海酶联生物科技有限公司；TRIzol购自Servicebio、引物购自天一辉远、Evo M-MLV RT Mix Kit with gDNA Clean for qPCR Ver.2购自艾克瑞生物；木瓜蛋白酶、L-半胱氨酸、瑞氏染色液等试剂购自北京索莱宝科技有限公司。
1.3.3 实验仪器光学显微镜（日本奥巴斯公司）、EVF3电子Vonfrey测痛仪（法国Bioseb公司）、BW-Plantar 390足底热测痛仪（美国IITC公司）、酶标检测仪（美国伯滕仪器有限公司）、QuantStudio 5型实时荧光定量PCR仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）。
1.3.4 分组及造模将36只雌性SD大鼠适应性喂养1周后，按体质量排序后采用随机数字表法分为假手术组（6只）和造模组（30只）。造模组大鼠采用“卵巢切除+关节腔注射”复合方法建立肾阳虚型KOA模型[4]：1）卵巢切除术：腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，于背部脊柱两侧切口，暴露卵巢，结扎并切除双侧卵巢，逐层缝合。术后连续3 d肌注青霉素钠（4 000 U/只）预防感染。假手术组仅切除卵巢附近同等体积的脂肪组织。2）去势成功验证：术后第5天开始，连续5 d行阴道涂片检查。用棉签蘸取生理盐水轻柔插入大鼠阴道，旋转后涂于载玻片，95%乙醇固定，瑞氏染色，光镜下观察阴道上皮细胞类型。若涂片持续呈现大量白细胞、无周期性变化（处于动情间期），提示卵巢切除成功。3）KOA诱导：去势成功大鼠于术后第10天开始行右膝关节腔注射。将4%木瓜蛋白酶与0.03 mol/L L-半胱氨酸按2∶1体积比混合，每次注射0.15 mL，间隔3 d注射1次，共注射2次。注射后3 d，采用Lequesne MG评分法，综合评估大鼠膝关节的局部疼痛、关节肿胀、步态变化及关节活动度等指标，若评分≥3分视为KOA造模成功[5]。
造模成功后，将造模组大鼠按随机数字表法分为模型组、阳性对照组、补肾壮膝方低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组6只。
1.3.5 给药方法各组于造模成功后次日开始灌胃给药，每日1次，连续28 d。补肾壮膝方低、中、高剂量组按浸膏粉计分别为127.0、253.9、507.8 mg/kg。经前期工艺测定，4.05 kg生药提取出0.8 kg浸膏粉（提取率19.6%）。中剂量253.9 mg/kg约相当于人临床生药日剂量15 g的等效剂量（按体表面积换算系数6），低、高剂量分别为其1/2和2倍。假手术组、模型组：灌胃等体积蒸馏水。
1.3.6 观察指标 1.3.6.1 一般情况及肾阳虚证候评价观察各组大鼠畏寒、精神、活动、毛发、二便情况，进行半定量评分（总分0~10分）[6]；末次给药后检测血清促卵泡激素（FSH）、雌二醇（E2）、皮质酮（CORT）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、环磷酸腺苷（cAMP）/环磷酸鸟苷（cGMP）水平。见表 1。
| 体征 | 评分细则 | 分数 |
| 畏寒情况 | 持续蜷缩、扎堆、皮毛耸立 | 2 |
| 偶尔蜷缩、喜扎堆 | 1 | |
| 姿态舒展, 活动自如 | 0 | |
| 精神状态 | 反应迟钝, 嗜睡, 刺激后无或弱反应 | 2 |
| 精神萎靡, 反应迟缓 | 1 | |
| 反应灵敏, 精神尚可 | 0 | |
| 行为活动 | 活动量显著减少, 几乎不移动 | 2 |
| 活动量减少, 行动迟缓 | 1 | |
| 活动量正常, 探索行为活跃 | 0 | |
| 毛发状态 | 毛色枯黄、无光泽, 严重稀疏或脱落 | 2 |
| 毛色暗淡、凌乱, 轻微脱落 | 1 | |
| 毛色洁白、有光泽, 浓密顺滑 | 0 | |
| 二便情况 | 尿量增多, 笼盒内垫料潮湿明显 | 1 |
| 尿量正常 | 0 | |
| 粪便稀软或不成形 | 1 | |
| 粪便成形, 正常 | 0 | |
| 注：轻度肾阳虚：总分3~5分（主要表现畏寒、精神不振）；中度肾阳虚：总分6~8分（伴有明显活动减少、毛发改变）；重度肾阳虚：总分9~10分（多项指标严重异常）。 | ||
机械痛阈：采用电子VonFrey测痛仪，刺激右后肢足底，记录抬足或舔足反应时的压力值，重复3次取均值。热痛阈：采用热板仪（55.0±0.5）℃，记录大鼠接触热板至抬足或舔足时间，重复3次取均值。
1.3.6.3 膝关节肿胀度与Lequesne MG评分于给药前、给药第28天测量右膝关节直径，计算肿胀度；采用Lequesne MG评分评估关节功能（包括局部疼痛、步态变化、关节活动范围、关节肿胀）[7]。见表 2。1.3.6.4血清与关节液生化指标检测采用ELISA法检测血清COLⅡ、Aggrecan、SOX9、CTX-Ⅱ、MMP-13、ADAMTS-5水平；关节液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平按试剂盒说明检测。
| 评分方面 | 分数 | 描述 |
| 局部疼痛 | 0 | 疼痛 |
| 1 | 无右后肢收缩 | |
| 2 | 右后肢收缩、痉挛且伴有轻度全身反应 | |
| 3 | 右后肢剧烈收缩且出现痉挛、挣扎并伴有异常叫声 | |
| 步态变化 | 0 | 步态正常 |
| 1 | 右后肢轻度跛行 | |
| 2 | 明显跛行 | |
| 3 | 不能接触地面或拖地行走 | |
| 膝关节活动范围 | 0 | 90°以上 |
| 1 | 45°~90° | |
| 2 | 15°~45° | |
| 3 | 15°以下 | |
| 关节肿胀状况 | 0 | 未见肿胀 |
| 1 | 轻度肿胀且骨性标志变浅 | |
| 2 | 明显肿胀且骨性标准消失 | |
| 注：总分=局部疼痛评分+步态变化评分+膝关节活动范围评分+ 关节肿胀状况评分。 | ||
末次给药后，处死大鼠，分离右膝关节，切开关节囊，暴露股骨髁与胫骨平台，用无菌手术刀片刮取关节软骨组织，置于预冷的TRIzol中。TRIzol法提取关节软骨组织总RNA，反转录cDNA，SYBR Green法检测PI3K、AKT、NF-κB p65、IκBα mRNA表达，以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法计算相对表达量。引物序列见表 3。
| 基因 | 引物序列(5′-3′) | 产物长度(bp) |
| GAPDH | 上游: AGACAGCCGCATCTTCTTGT | 166 |
| 下游: CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT | ||
| PI3K | 上游: AGCAGGTACCCTGGTGATTG | 219 |
| 下游: AGAAGGCACAGGTCCAGAGA | ||
| AKT | 上游: GATGGACTCAAACGGCAGGA | 126 |
| 下游: CTCGTTCATGGTCACACGGT | ||
| NF-κB p65 | 上游: CTGGCCATGGACGATCTGTTT | 120 |
| 下游: GCACTTGTAACGGAAACGCA | ||
| IκBa | 上游: CACGGAAGATGAGTTGCCCT | 91 |
| 下游: CAAGTCCACGTTCCTTTGGC |
采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料首先采用Shapiro-Wilk检验判断正态性，Levene检验判断方差齐性。符合正态分布且满足方差齐性检验，采用单因素方差分析（ANOVA），结果以均数±标准差（x±s）表示；不符合正态分布或方差不齐者，采用Kruskal-Wallis H检验，结果以中位数（四分位距）M（P25，P75）表示。等级资料（如肾阳虚证候评分、Lequesne MG评分）亦采用Kruskal-Wallis H检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 质谱鉴定补肾壮膝方化学成分采用UPLC-Q-TOF-MS技术在正、负离子模式下对补肾壮膝方提取物进行分析，得到基峰离子流图（BPC，图 1A，1B）和紫外色谱图（图 1C）。通过与数据库及文献比对，共鉴定出74个化合物（表 4）。其中包括酚类（如松果菊苷、毛蕊花糖苷）、黄酮类（如毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素）、苯丙素类（如阿魏酸、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷）、三萜皂苷类（如牛膝皂苷、黄芪甲苷）、甾体类（如β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮）、单帖类（如芍药苷、京尼平苷酸）、生物碱类（如N-反式-阿魏酰酪胺）等多种类型，这些化合物分别来源于方中各味药材。
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| 注：图 A，负离子模式；图 B，正离子模式；图 C，UV 254 nm 色谱图。 图 1 补肾壮膝方化学成分的总离子流图 Fig. 1 Total ion current diagram of the chemical components of the Bushen Zhuangxi Formula |
| 序号 | 保留时间(min) | 加合离子 | 实测m/z | 分子式 | 中文名 | 主要碎片离子(MS/MS) | 归属 |
| 1 | 16.78 | [M-H]- | 785.248 6 | C35H46O20 | 松果菊苷 | 785.247 4, 623.216 5, 161.024 2 | 肉苁蓉 |
| 2 | 19.39 | [M-H]- | 623.197 7 | C29H36O15 | 毛蕊花糖苷 | 623.199 3, 461.168 3, 315.107 1, 161.024 2 | 肉苁蓉 |
| 3 | 14.52 | [M+FA-H]- | 525.162 0 | C23H28O11 | 芍药苷 | 525.162 0, 449.142 7, 327.106 0, 165.055 0 | 芍药 |
| 4 | 15.88 | [M-H]- | 193.051 0 | C10H10O4 | 阿魏酸 | 193.051 0, 178.027 2, 149.061 0, 134.037 1 | 当归 |
| 5 | 10.57 | [M-H]- | 353.087 8 | C16H18O9 | 绿原酸 | 353.087 8, 191.056 3, 173.046 8, 161.024 6 | 杜仲/当归/川芎/木瓜 |
| 6 | 19.01 | [M+FA-H]- | 525.309 0 | C27H44O7 | β-蜕皮甾酮 | 525.310 2, 479.304 0, 319.192 7, 159.103 4 | 酒牛膝 |
| 7 | 15.77 | [M+FA-H]- | 727.245 4 | C32H42O16 | 松脂醇二葡萄糖苷 | 681.242 7, 519.188 1, 357.133 3, 151.039 7 | 杜仲 |
| 8 | 28.43 | [M+FA-H]- | 829.460 5 | C41H68O14 | 黄芪甲苷 | 829.458 7, 783.456 6 | 黄芪 |
| 注：加合离子[M-H]-为去质子离子[M+FA-H]-为甲酸加合离子。实测m/z与理论值误差均小于5 ppm。 | |||||||
通过Swiss Target Prediction平台预测，获得补肾壮膝方74个成分的潜在靶点，经去重后得到药物靶点。从GeneCards、NCBI和CTD数据库获得3 230个KOA相关疾病靶点。将药物靶点与疾病靶点取交集，得到122个共有靶点（图 2A），这些靶点是补肾壮膝方可能通过其成分治疗KOA的潜在作用靶点。
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| 注：图A，药物-疾病靶点韦恩图；图B，成分-疾病-靶点网络图；图C，PPI网络图；图D，核心靶点度值条形图。 图 2 网络药理学分析结果 Fig. 2 Results of network pharmacology analysis |
构建“成分-疾病-靶点”网络（图 2B），显示补肾壮膝方的多种成分可作用于多个靶点，体现了中药复方的整体性特点。将122个共有靶点导入STRING数据库构建PPI网络（图 2C），该网络包含122个节点和1 436条边。通过Cystoscape 3.8.0拓扑分析，按度值排序，排名前5的核心靶点为肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素6（IL6）、蛋白激酶B1（AKT1）、连环蛋白β1（CTNNB1）、信号转导及转录激活因子3（STAT3）。图 2D。
2.2.3 GO和KEGG富集分析GO富集分析显示，共富集到2 132条生物过程（BP）、127项分子功能（MF）和61项细胞组分（CC）。BP主要涉及炎症反应、细胞对脂多糖的反应等；MF主要涉及蛋白激酶活性、细胞因子受体结合等（图 3A）。KEGG富集分析显示，共富集到167条信号通路（P < 0.05）。根据富集基因数排序，前20条通路主要包括PI3K-AKT信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路等（图 3B）。其中，PI3K-AKT和NF-κB通路与KOA的软骨合成与分解代谢密切相关，是本研究的重点。
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| 注：图A，GO富集分析；图B，KEGG通路富集分析。 图 3 GO和KEGG富集分析 Fig. 3 GO and KEGG enrichment analysis |
分子对接结合能见表 5，对接结果图见图 4。芍药苷与TNF（-9.0 kcal/mol）最强；黄芪甲苷与TNF（-8.1 kcal/mol）、绿原酸与TNF（-7.8 kcal/mol）亦为强结合；各成分与AKT1结合能为-6.5~-5.5 kcal/mol，显示较好结合；与RELA结合能为-4.9~-4.6 kcal/mol，具有一定结合活性。氢键和疏水相互作用分析进一步证实了成分与靶点的稳定结合。
| 蛋白及PDB ID | 化合物名称 | 结合能(kcal/mol) |
| AKT1(2UVM) | 黄芪甲苷 | -6.5 |
| TNF(2E7A) | 黄芪甲苷 | -8.1 |
| AKT1(2UVM) | 绿原酸 | -5.5 |
| RELA(6NV2) | 绿原酸 | -4.6 |
| TNF(2E7A) | 绿原酸 | -7.8 |
| AKT1(2UVM) | 芍药苷 | -6.5 |
| RELA(6NV2) | 芍药苷 | -4.9 |
| TNF(2E7A) | 芍药苷 | -9.0 |
| AKT1(2UVM) | β-蜕皮甾酮 | -6.4 |
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| 注：图A，芍药苷-TNF；图B，黄芪甲苷-TNF；图C，绿原酸-TNF。 图 4 关键靶点与部分活性成分分子对接结果图 Fig. 4 Results diagram of molecular docking between key targets and some active ingredients |
术后第5天连续阴道涂片观察显示：假手术组大鼠呈现规律的动情周期，而卵巢切除组大鼠阴道涂片始终以大量白细胞为主，持续处于动情间期，提示卵巢切除成功（图 5）。第2次关节腔注射木瓜蛋白酶后3 d，模型组大鼠右膝关节出现明显红肿疼痛、活动受限，Lequesne MG评分≥3分，提示KOA模型建立成功（表 6）。
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| 图 5 模型组大鼠阴道涂片（×200，100 μm） Fig. 5 Vaginal smears of model group rats (×200, 100 μm) |
| 分 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | 动物数 | 第0天 | 第28天 | ||||||||||||||||||||||||||
| 假手术组 | 6 | 0.00(0.00, 1.00) | 0.00(0.00, 0.00) | ||||||||||||||||||||||||||
| 模型组 | 6 | 8.50(8.00, 9.00)# | 8.50(8.00, 9.25)### | ||||||||||||||||||||||||||
| 阳性药组 | 6 | 8.50(7.75, 9.00)# | 4.50(3.75, 5.25)* | ||||||||||||||||||||||||||
| 补肾壮膝方低剂量组 | 6 | 8.50(7.50, 9.00)# | 6.50(5.75, 7.25) | ||||||||||||||||||||||||||
| 补肾壮膝方中剂量组 | 6 | 8.50(8.00, 9.25)# | 5.00(4.75, 6.25) | ||||||||||||||||||||||||||
| 补肾壮膝方高剂量组 | 6 | 8.50(7.75, 9.00)# | 4.50(3.75, 5.25)* | ||||||||||||||||||||||||||
| 注：与假手术相比，#P < 0.05，###P < 0.001；与模型组相比，*P < 0.05。 | |||||||||||||||||||||||||||||
与假手术组比较，模型组肾阳虚证候评分明显升高（P < 0.001）；与模型组比较，阳性药组和补肾壮膝方高剂量组肾阳虚证候评分降低（P < 0.05），而低中剂量组改善不明显。与假手术组比较，模型组cAMP、cAMP/cGMP比值下降（P < 0.01或P < 0.001），cGMP水平上升（P < 0.05）；与模型组比较，阳性药组cAMP、cAMP/cGMP比值升高（P < 0.01或P < 0.001），低剂量组cAMP升高（P < 0.05），中剂量组cAMP、cAMP/cGMP比值升高（P < 0.001），高剂量组cAMP/cGMP比值升高（P < 0.001），而cGMP降低（P < 0.05）。见表 7和图 6。
| 分 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | 动物数 | 第0天 | 第28天 | ||||||||||||||||||||||||||
| 假手术组 | 6 | 0.00(0.00, 0.25) | 0.00(0.00, 1.00) | ||||||||||||||||||||||||||
| 模型组 | 6 | 8.50(7.75, 9.25)# | 8.00(7.00, 9.00)### | ||||||||||||||||||||||||||
| 阳性药组 | 6 | 8.50(7.75, 9.25)# | 3.00(2.75, 4.00)* | ||||||||||||||||||||||||||
| 补肾壮膝方低剂量组 | 6 | 8.50(7.75, 9.25)# | 5.00(4.00, 5.25) | ||||||||||||||||||||||||||
| 补肾壮膝方中剂量组 | 6 | 9.00(8.00, 9.00)# | 4.00(3.00, 5.00) | ||||||||||||||||||||||||||
| 补肾壮膝方高剂量组 | 6 | 8.50(7.75, 9.25)# | 3.00(3.00, 4.00)* | ||||||||||||||||||||||||||
| 注：与假手术相比，#P < 0.05，###P < 0.001；与模型组相比，*P < 0.05。 | |||||||||||||||||||||||||||||
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| 注：与假手术相比，###P < 0.001；与模型组相比，*P < 0.05，***P < 0.001；动物数=6。 图 6 各组大鼠阳虚生物学指标水平及下丘脑-垂体-靶腺轴功能（x±s） Fig. 6 The levels of biological indicators of yin deficiency in each group of rats and the function of the hypothalamus-pituitary-target gland axis (x±s) |
与假手术组比较，模型组CORT、ACTH、E2水平下降（P < 0.01或P < 0.001），FSH水平升高（P < 0.01）；与模型组比较，阳性药组CORT、ACTH、E2水平升高（P < 0.01），FSH水平下降（P < 0.01），低中剂量组CORT和E2水平升高（P < 0.05），中剂量组FSH水平降低（P < 0.05），高剂量组CORT、ACTH和E2水平升高（P < 0.05或P < 0.01），FSH水平下降（P < 0.01）。见图 6。
2.3.3 补肾壮膝方提高肾阳虚KOA大鼠痛阈与假手术组比较，模型组大鼠机械痛阈和热痛阈显著降低（P < 0.05或P < 0.001）。与模型组相比，阳性对照组机械痛阈和热痛阈升高（P < 0.01或P < 0.001），补肾壮膝方低、中、高剂量组机械痛阈和热痛阈亦显著升高（P < 0.05或P < 0.01）。见图 7。
|
| 注：与假手术相比，#P<0.05，###P<0.001；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；动物数=6。 图 7 各组大鼠机械痛和热痛阈值（x±s） Fig. 7 Mechanical pain threshold and thermal pain threshold of rats in each group (x±s) |
与假手术组比较，模型组右膝关节肿胀度明显增加，Lequesne MG评分升高（P < 0.001）。与模型组比较，阳性对照组、补肾壮膝方低、中、高剂量组有明显的抑制肿胀作用（P < 0.05或P < 0.001），阳性对照组和补肾壮膝方高剂量组Lequesne MG评分降低（P < 0.05），而低、中剂量组改善不明显。见表 6和图 8。
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| 注：与假手术相比，###P<0.001；与模型组相比，*P<0.05，***P<0.001；动物数=6。 图 8 各组大鼠右膝关节肿胀度（x±s） Fig. 8 The swelling degree of the right knee joint of rats in each group (x±s) |
血清检测结果：与假手术组比较，模型组血清COLⅡ、Aggrecan、SOX9水平降低（P < 0.001），CTX-Ⅱ、MMP-13、ADAMTS-5水平升高（P < 0.001）。与模型组比较，阳性对照组COLⅡ、Aggrecan、SOX9水平升高（P < 0.05或P < 0.01），补肾壮膝方中、高剂量组COLⅡ、Aggrecan、SOX9水平升高（P < 0.05或P < 0.01）；阳性对照组CTX-Ⅱ、MMP-13、ADAMTS-5水平降低（P < 0.001），低剂量组MMP-13水平降低（P < 0.01），中剂量组CTX-Ⅱ、MMP-13水平降低（P < 0.01），高剂量组CTX-Ⅱ、MMP-13、ADAMTS-5水平降低（P < 0.01或P < 0.001）。关节液检测结果：与假手术组比较，模型组关节液中IL-1β、IL-6、TNF-α含量升高（P < 0.001）。与模型组比较，阳性对照组IL-1β、IL-6、TNF-α含量降低（P < 0.001），补肾壮膝方中、高剂量组IL-1β、IL-6、TNF-α含量降低（P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001）。见图 9。
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| 注：与假手术相比，###P<0.001；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；动物数=6。 图 9 各组大鼠血清及关节液生化指标（x±s） Fig. 9 Biochemical indicators of serum and joint fluid of rats in each group (x±s) |
qRT-PCR结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠软骨组织中PI3K、AKT、NF-κB p65和IκBα的mRNA表达均显著升高（P < 0.05或P < 0.001）。与模型组比较，阳性对照组能显著下调PI3K、AKT、NF-κB p65、IκBα的mRNA表达（P < 0.05或P < 0.001），补肾壮膝方低、中、高剂量组可显著下调PI3K、AKT、IκBα的mRNA表达（P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001），高剂量可下调NF-κB p65的mRNA表达（P < 0.05）。见图 10。
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| 注：与假手术相比，#P<0.05，###P<0.001；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；动物数=6。 图 10 各组大鼠关节软骨PI3K、AKT、NF-κB、IκBα mRNA表达情况（x±s） Fig. 10 The PI3K, AKT, NF-κB, IκBα mRNA expression levels of articular cartilage of rats in each group (x±s) |
KOA属中医“痹证”“骨痹”范畴，其核心病机为“本痿标痹”：肝肾亏虚、精血不足为本，风寒湿邪、痰瘀痹阻为标[8]。《张氏医通》云：“膝为筋之府，膝痛无有不因肝肾虚者[9]。”肝主筋、肾主骨，肝肾不足则筋骨失养，不荣则痛，复感外邪则痹阻经脉，不通则痛。补肾壮膝方正是基于这一病机而设。方中酒牛膝，味酸苦，性平，归肝、肾经，功能补肝肾、强筋骨、散瘀血、消痈肿；杜仲甘温，善补肝肾、强筋骨，《神农本草经》谓其“主腰脊痛，补中，益精气，坚筋骨”[10]。肉苁蓉温补肾阳、益精血，兼能润养筋脉；黄芪、当归具有益气养血，行滞通痹的功效，助以复肾阳、充气血；白芍养血柔肝、缓急止痛，川芎为“血中气药”活血行气；木瓜舒筋活络、化湿和胃；牛膝又可引诸药下行直达膝部。全方共奏补肝肾、强筋骨为本，兼活血通络、濡养筋脉之功，使膝部筋骨得养、瘀滞得通。
本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技术共鉴定出补肾壮膝方中74个主要化学成分，涵盖酚类、黄酮类、苯丙素类、三萜皂苷类、甾体类、单帖类、生物碱类等多种结构类型。这些成分的现代药理活性为阐释该方的传统功效提供了物质基础。松果菊苷和毛蕊花糖苷是肉苁蓉（君药）中特征性的酚类成分。研究证实，松果菊苷能够促进骨关节炎软骨细胞增殖，抑制IL-1β、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）等炎性因子的表达，同时上调聚集蛋白聚糖（ACAN）和糖胺聚糖（GAG）的合成、下调MMP-13的表达，从而延缓软骨退变[11]。方中酒牛膝（君药）所含的β-蜕皮甾酮属于植物甾酮类，研究表明其不仅具有促进成骨细胞增殖与分化的活性，还能通过调节多种信号通路干预糖皮质激素性骨质疏松，体现了“肾主骨”理论的分子内涵[12-13]。白芍（佐药）中的芍药苷是一种具有显著抗炎活性的单萜苷类成分，可通过抑制NF-κB信号通路减少白细胞介素-9（IL-9）和IL-1β的生成，还可通过抑制PI3K/AKT信号促进软骨细胞自噬，发挥软骨保护作用[14-15]。阿魏酸和绿原酸分别来源于当归（臣药）、川芎（佐药）及杜仲（君药）等多种药材，前者具有抗氧化和抗炎作用[16]，后者可调控免疫细胞分化，抑制软骨细胞凋亡[17]。上述成分分别对应方中君、臣、佐、使之药，协同体现了“温阳与养血同行，补肾与通络并重”的组方特色，构成了“多成分-多靶点-多通路”的调控网络。网络药理学分析进一步揭示了补肾壮膝方治疗KOA的潜在机制：PPI网络拓扑分析筛选出TNF、IL-6、AKT1、CTNNB1和STAT3等核心靶点，这些靶点高度富集于炎症反应调控和软骨代谢相关的信号通路。KEGG富集分析表明，PI3K-AKT信号通路和NF-κB信号通路是补肾壮膝方发挥作用的核心通路。分子对接结果显示，芍药苷、黄芪甲苷、绿原酸分别与TNF表现出强结合活性，各成分与AKT1结合能-6.5~-5.5 kcal/mol，与RELA结合能-4.9~-4.6 kcal/mol，进一步佐证了上述核心成分与关键靶点的直接相互作用。由此可见，补肾壮膝方可通过多种活性成分，于不同途径协同发挥抗炎、镇痛和软骨保护作用。
在模型建立方面，本研究采用“卵巢切除联合关节腔注射木瓜蛋白酶”的复合造模方法，以实现病证结合的建模目标。卵巢切除术后，阴道涂片持续呈现大量白细胞、无周期性变化，提示去势成功[18]；模型组大鼠出现畏寒倦卧、精神萎靡等肾阳虚表现，肾阳虚证候评分显著升高，血清CORT、ACTH、E2水平下降，FSH水平升高，cAMP/cGMP比值降低，符合肾阳虚证的分子特征[19-20]。木瓜蛋白酶关节腔注射后，大鼠右膝关节明显肿胀，Lequesne MG评分均≥3分，证实KOA造模成功[21]。两者结合能够较好地模拟临床上肾阳虚型KOA“肾虚为本、痹痛为标”的病证特点。动物实验结果显示，补肾壮膝方能够显著改善肾阳虚KOA大鼠的一般状态和肾阳虚证候，提高机械痛阈和热痛阈，减轻膝关节肿胀度，降低Lequesne MG评分。痛阈检测是评价KOA疼痛严重程度和药物镇痛效果的重要行为学指标：机械痛阈反映外周和中枢敏化程度[22]，热痛阈则主要与C纤维介导的疼痛传导有关[23]。补肾壮膝方对两种痛阈的同时升高表明其可能通过多种机制调节疼痛信号传导，这与方中既含有抗炎成分又含有活血止痛成分的组方特点相吻合。膝关节肿胀度的减轻和Lequesne MG评分的降低则从客观指标和功能评价两个维度共同验证了补肾壮膝方改善关节功能的作用。
在生化指标层面，KOA的关节局部微环境以促炎因子升高和软骨基质代谢失衡为特征[24]。TNF-α、IL-1β和IL-6是KOA炎症-退变级联反应的核心驱动因子[25]，关节液/血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平可作为KOA早期诊断、病情监测和预后评估的参考指标[26]。COLⅡ是关节软骨最主要的框架结构蛋白[27]，Aggrecan是赋予软骨抗压弹性的主要蛋白聚糖[28]，SOX9则是驱动COLⅡ和Aggrecan等软骨特异性基因转录的核心调控因子[29]。CTX-Ⅱ是Ⅱ型胶原降解的特异性产物[30]，MMP-13被认为是KOA软骨降解过程中最重要的胶原酶[31]，ADAMTS-5则是降解蛋白聚糖的关键酶[32]。本研究结果显示，补肾壮膝方中、高剂量组能显著降低关节液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，同时显著升高COLⅡ、Aggrecan和SOX9水平，降低血清中MMP-13、ADAMTS-5和CTX-Ⅱ水平。这些指标的变化表明该方不仅能抑制炎症因子的释放，还能在合成代谢和分解代谢上调节软骨基质稳态。
在KOA病理条件下，IL-1β、TNF-α、IL-6等促炎因子可独立激活PI3K-AKT与NF-κB两条信号通路[33-34]。PI3K-AKT通路在生理状态下通过维持SOX9的表达促进COLⅡ和Aggrecan合成[35]，并通过抑制凋亡、促进自噬维持软骨细胞稳态[36]。但在KOA微环境中，持续过度激活的PI3K-AKT信号可抑制软骨细胞自噬，导致受损细胞器积聚[37]。NF-κB通路的异常活化驱动软骨分解代谢，活化的p65入核后转录上调MMP-13和ADAMTS-5的表达，导致COLⅡ和Aggrecan降解，CTX-Ⅱ随之升高[38]。而活化的PI3K-AKT又可通过IKK/IκBα节点增强NF-κB的转录活性[39]。NF-κB驱动的促炎因子反过来再次激活PI3K-AKT[24]，形成“独立启动-交叉增强-正反馈放大”的通路串扰回路，最终导致软骨基质降解酶持续高表达和关节炎症恶性循环。KOA病理机制示意图见图 11。
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| 注：图片通过BioGDP.com绘制。KOA，膝骨关节炎；IL-1β，白细胞介素-1β；TNF-α，肿瘤坏死因子-α；IL-6，白细胞介素-6；PIP3，磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸；PI3K-AKT，磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B；NF-κB，核因子-κB；IKK，IκB激酶；IκBα，核因子-κB抑制蛋白α；IL-1R，白细胞介素1受体；TNFR，肿瘤坏死因子受体；MMP-13，基质金属蛋白酶-13；ADAMTS-5，含血小板反应蛋白基序的解整合素金属蛋白酶5；COL Ⅱ，Ⅱ型胶原蛋白；Aggrecan，聚集蛋白聚糖；CTX-Ⅱ，Ⅱ型胶原羧基端端肽；SOX9，性别决定区Y框蛋白9。 图 11 KOA病理机制示意图 Fig. 11 Schematic of KOA pathogenesis |
本研究的qRT-PCR结果显示，模型组大鼠软骨组织中PI3K、AKT、NF-κB p65和IκBα的mRNA表达均显著上调，表明该正反馈循环被激活。补肾壮膝方干预后，上述所有基因的表达均被显著下调，提示该方中的多种活性成分可能同时作用于两条通路的多个节点，方中的芍药苷可抑制PI3K/AKT信号并促进软骨细胞自噬[14]，松果菊苷和毛蕊花糖苷可抑制NF-κB活化和炎性因子释放[11]，β-蜕皮甾酮可调节AKT通路保护骨骼系统[40]。补肾壮膝方可能通过“多成分-多靶点”的协同作用，同时阻断了两条通路之间的恶性反馈循环，协同抑制炎症和基质降解，体现了中药复方整体调控的独特优势。
本研究仍存在一定局限性。质谱鉴定的74个成分尚未逐一进行靶点验证和活性筛选，部分低含量成分的贡献尚不明确。其次，动物实验仅设置了阳性对照药，未设置PI3K特异性抑制剂或NF-κB阻断剂对照组，因此无法直接证实PI3K-AKT/NF-κB通路是补肾壮膝方发挥药效的核心机制，目前结论主要基于网络药理学预测及mRNA表达水平的关联分析。此外，本研究仅检测了mRNA水平的表达变化，未对通路蛋白的总表达量及磷酸化状态（如p-AKT、p-IκBα、p-p65）进行Western blot验证，机制证据链的完整性有待加强。后续研究应结合血清药物化学确定补肾壮膝方的体内药效物质，利用基因敲除或通路特异性抑制剂进行因果验证，并引入磷酸化蛋白组学技术深入阐明补肾壮膝方调控通路串扰的精确分子机制。
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2. School of Traditional Chinese Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830017, China