2026, Vol. 43文章信息
- 马梦瑶, 江瑾, 李雯雯, 等.
- MA Mengyao, JIANG Jin, LI Wenwen, et al.
- 基于谱效关系分析白芍减轻雷公藤肝毒性的活性成分
- Analysis of active components of Paeoniae Radix Alba to reduce hepatotoxicity of Tripterygium wilfordii based on spectrum-effect relationship
- 天津中医药, 2026, 43(9): 1151-1160
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2026, 43(9): 1151-1160
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2026.09.09
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文章历史
- 收稿日期: 2026-04-28
引用本文 |
2. 津药达仁堂集团股份有限公司第六中药厂，天津 300000
雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. f.）作为中国传统中药，在治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、肾病综合征等自身免疫性疾病方面具有显著疗效[1]，其活性成分雷公藤甲素等已被证实具有强效的抗炎与免疫调节作用[2]。雷公藤多苷片是由雷公藤去皮根部提取物经色谱纯化后得到的粉末制成的片剂，2022年《中成药治疗类风湿关节炎（RA）临床应用指南》中将其列为被推荐药物的首位，其治疗RA的达标率与甲氨蝶呤和柳氮磺吡啶等一线药物接近，被世界卫生组织（WHO）认定为治疗关节炎的“中国首创植物新药制剂”。然而，雷公藤的临床应用常伴随明显的肝毒性，严重时可导致药物性肝损伤，甚至肝功能衰竭，这极大限制了临床推广与安全使用[3]。因此，探寻有效减轻或预防雷公藤肝毒性的策略，已成为中医药现代化研究中的一项重要课题。
有毒药物通过联合治疗可达到减少不良反应、提高药物敏感性并增强抗耐药性的作用，是实现其临床合理用药的有效途径[4-5]。白芍（Paeoniae RadixAlba）为常用养血柔肝、平抑肝阳之品，临床常与雷公藤联合使用[6-7]。若类风湿关节炎患者单用雷公藤治疗3个月疗效未达标，共识建议联用白芍总苷胶囊。现代药理研究表明，白芍提取物及其主要成分（如芍药苷、芍药内酯苷等）具有抗炎、抗氧化、抗凋亡及肝保护等多重生物活性[8]。然而，白芍中具体哪些化学成分在减轻雷公藤肝毒性中发挥关键作用，其物质基础尚未完全阐明，这制约了其联用减毒作用的精准阐释与质量控制。
近年来，“谱效关系”分析策略为阐释中药多成分、多靶点的药效物质基础提供了强有力的研究手段[9]。该策略将中药化学成分指纹图谱与特定药效学指标进行数学关联，能够系统筛选出与药效活性密切相关的化学成分群，契合中医药整体观与协同作用的特点。灰色关联度分析（GRA）、主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）等多元统计方法的联合应用，可多维度、交叉验证活性成分，显著提升筛选结果的可靠性[10]。
因此，本研究旨在整合现代分析技术与多元统计方法，系统开展白芍减轻雷公藤肝毒性的谱效关系研究。采用UPLC-Q-TOF-MS技术建立20批白芍样品的化学成分指纹图谱，以雷公藤诱导的HepG2肝细胞损伤模型评价其减毒药效，综合运用GRA、PCA及OPLS-DA等多种分析方法，构建化学成分与减毒活性之间的关联模型，筛选关键活性成分，并通过细胞实验进行多维度验证。本研究旨在明确白芍联合雷公藤减毒的物质基础，为临床安全应用雷公藤制剂提供科学依据。
1 材料UPLC-Q-TOF-MS联用仪（美国Waters公司）；高速多功能粉碎机（广州市渲龙厨具有限公司）；AX224ZH型十万分之一分析天平（奥豪斯仪器有限公司）；酶标仪（美国BioTek Instruments公司）；Invitrogen EVOS M7000成像系统（美国Thermo Fisher Scientific公司）。
CCK8试剂盒（Biosharp，货号：ALX-850-039-0100）；天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒、丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号：C010-2-1、C009-2-1）；二甲基亚砜（Solarbio，货号：67-68-5）；甲醇、甲酸为质谱纯，其余试剂均为分析纯。
雷公藤药材购自安徽亳州市康易饮生物科技有限公司，经天津中医药大学中药学院李先宽副教授鉴定为卫矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook. f.的干燥根；白芍药材20批分别购自安徽亳州、四川中江和广东普宁，具体信息见表 1。
| 编号 | 批号 | 来源 | 生长年限(年) | 采集时间 |
| S1 | 2023304201 | 安徽亳州千翁堂药材有限公司 | 4 | 2023年9月 |
| S2 | 2023304202 | 安徽亳州千翁堂药材有限公司 | 4 | 2023年9月 |
| S3 | 2023304203 | 安徽亳州千翁堂药材有限公司 | 4 | 2023年9月 |
| S4 | 2023401301 | 四川寻百草药业有限公司 | 3 | 2023年10月 |
| S5 | 2023401302 | 四川寻百草药业有限公司 | 3 | 2023年10月 |
| S6 | 2023605409 | 广东万润药材公司(普宁) | 3 | 2023年10月 |
| S7 | 2023037601 | 安徽亳州华芝源药业有限公司 | 4 | 2023年9月 |
| S8 | 2023037602 | 安徽亳州华芝源药业有限公司 | 4 | 2023年9月 |
| S9 | 2023037603 | 安徽亳州华芝源药业有限公司 | 4 | 2023年9月 |
| S10 | 2023037604 | 安徽亳州华芝源药业有限公司 | 4 | 2023年9月 |
| S11 | 2023037605 | 安徽亳州华芝源药业有限公司 | 4 | 2023年9月 |
| S12 | 2023027801 | 安徽亳州仙太生物药业有限公司 | 4 | 2023年9月 |
| S13 | 2023027802 | 安徽亳州仙太生物药业有限公司 | 4 | 2023年9月 |
| S14 | 2023027803 | 安徽亳州仙太生物药业有限公司 | 4 | 2023年9月 |
| S15 | 2023027804 | 安徽亳州仙太生物药业有限公司 | 4 | 2023年9月 |
| S16 | 2023027805 | 安徽亳州仙太生物药业有限公司 | 4 | 2023年9月 |
| S17 | 2023027806 | 安徽亳州仙太生物药业有限公司 | 4 | 2023年9月 |
| S18 | 2023236601 | 安徽亳州康易饮生物科技有限公司 | 5 | 2023年9月 |
| S19 | 2023236602 | 安徽亳州康易饮生物科技有限公司 | 5 | 2023年9月 |
| S20 | 2023236603 | 安徽亳州康易饮生物科技有限公司 | 5 | 2023年9月 |
人肝癌细胞HepG2购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
2 方法 2.1 白芍指纹图谱建立及化学成分结构鉴定 2.1.1 供试品溶液的制备精密称取白芍粉末5.0 g，置于具塞锥形瓶中，加入50%乙醇25 mL并记录质量。经超声处理（150 W，40 Hz，30 min），冷却后补足质量，摇匀，离心（3 000 r/min，10 min，离心半径10 cm），取上清液过滤，即得。
2.1.2 色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC® CSHTM C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相A：0.1%甲酸-水；流动相B：甲醇；采用梯度洗脱（0~18 min，95%~72%A；18~24 min，72%~40%A；24~32 min，40%~5%A）；体积流量：0.2 mL/min；柱温：30 ℃；进样体积：5 μL。
2.1.3 质谱条件采用正、负离子模式下的电喷雾电离源（ESI），以高纯液氮为辅助气与脱溶剂气，扫描范围m/z 50~1 800，毛细管电压3.5 kV，离子源温度120 ℃，脱溶剂气温度320 ℃，锥孔气流速50 L/h，碰撞能量30~50 V。
2.1.4 方法学考察采用2.1.1方法制备S1批次白芍供试品溶液，通过计算各共有峰峰面积的相对标准偏差（RSD）进行以下考察：1）重复性：平行制备6份供试品溶液，按2.1.2条件进样分析。2）精密度：取同一份供试品溶液，连续进样6次。3）稳定性：将一份供试品溶液分别于0、2、4、8、12、24 h进样分析。
2.1.5 指纹图谱的建立与相似度评价取20批白芍样品，按2.1.1方法制备供试品溶液，分别按2.1.2条件进样分析，记录色谱图。将图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A版）软件中建立指纹图谱，计算指纹图谱相似度。
2.1.6 共有峰的确定与化学成分鉴定采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行共有峰标定，并运用UPLC-Q-TOF-MS技术获取共有峰化学组分信息，通过比对精确分子量、二级质谱碎片及文献报道的白芍化学成分质谱数据鉴定。
2.2 白芍减轻雷公藤肝毒性活性成分筛选 2.2.1 白芍联用雷公藤对HepG2细胞存活率的影响人肝癌细胞HepG2的培养条件为：含10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM高糖培养基，并于37℃, 5%CO2培养箱中维持。当细胞融合至80%~90%时，使用0.25%胰酶消化传代，后续实验均取对数生长期的细胞进行。
取对数生长期的HepG2细胞，以每孔5×103个细胞接种于96孔板，在37 ℃、5%CO2条件下培养24 h，设置28.13、56.25、112.5、225、450、900 μg/mL共6个雷公藤浓度梯度，每个组设3个复孔，继续培养24 h，吸出培养基，每孔加入100 μL CCK-8工作液孵育1 h，采用酶标仪于450 nm波长处测定每孔吸光度（A）值并计算其细胞存活率，确定雷公藤的浓度。随后，设置空白组、正常组（NC）、雷公藤组（450 μg/mL）、S1-雷公藤组~S20-雷公藤组（450 μg/mL），按照上述操作测定每孔吸光度（A）值并计算其细胞存活率。
细胞存活率=（实验组A值-空白组A值）/[（正常组A值-空白组A值）]×100%
2.2.2 GRA将白芍指纹图谱17个共有峰峰面积与HepG2细胞存活率数据分别作为比较序列（子因素）与参考序列（母因素）。数据经均值化处理后，设定分辨系数（§）为0.5，依次计算差序列、关联系数及关联度。
2.2.3 PCA对白芍指纹图谱的17个共有峰峰面积及HepG2细胞存活率数据分别进行Z-Score标准化，随后采用SPSS 23.0软件对标准化后的成分数据与细胞存活率进行主成分分析。
2.2.4 OPLS-DA以白芍样品指纹图谱中17个共有峰的峰面积为自变量（X），HepG2细胞存活率为因变量（Y），用SIMCA-P 13.5软件建立OPLS-DA模型，对两者关系进行分析。
2.3 潜在减毒活性成分的药效验证 2.3.1 活性成分对HepG2细胞存活率的影响将HepG2细胞按5×103个/孔接种于96孔板中，于37℃, 5%CO2条件下培养24 h，设置雷公藤甲素组（TP，0.000 4、0.004、0.04、0.4、0.8 mg/mL），按照2.2.1项操作，测定细胞存活率，确定TP作用浓度。随后，设置雷公藤甲素+芍药苷组（TP+SYG）、雷公藤甲素+芍药内酯苷组（TP+SYNZG）、雷公藤甲素+没食子酸组（TP+MSZS）、雷公藤甲素+苯甲酰芍药苷组（TP+BJXSYG）及雷公藤甲素+氧化芍药苷组（TP+ YHSYG），设置联用比例1∶500、1∶1 000、1∶1 500、1∶2 000、1∶2 500，按照2.2.1项操作，测定细胞存活率。
2.3.2 活性成分对HepG2细胞形态及上清液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）含量的影响将HepG2细胞按1.2×106个/孔接种于6孔板中，于37℃, 5%CO2条件下培养24 h，按照2.3.1项分组给药（0.4 mg/mL，1∶1 500），24 h后，使用M7000显微镜观察细胞形态，随后，取细胞培养基上清，严格按照试剂盒说明书操作测定细胞上清液AST、ALT含量。
2.4 统计学方法使用SPSS 23.0软件进行数据分析。所有计量资料均先经正态性与方差齐性检验。若数据符合方差齐性，则以均数±标准差（x±s）表示，并采用单因素方差分析进行组间比较；若方差不齐，则改用非参数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
3 结果 3.1 方法学考察实验结果表明，白芍样品各峰的保留时间及峰面积的RSD均小于3.0%，表明该方法重复性、精密度及稳定性符合要求，适用于建立白芍指纹图谱。
3.2 指纹图谱建立与化学成分鉴定将20批白芍样品色谱图导入中药指纹图谱相似度评价系统（2012A版），以S8批次为参照图谱，经多点校正与自动匹配生成对照指纹图谱，共标定17个分离度良好、可辨识的共有峰（1~17）。按2.1.6方法鉴定，结果见表 2[11-13]。20批样品相似度介于0.729~0.996，表明白芍不同批次间化学组成相似，但共有成分含量存在差异，见图 1-5。
| 峰号 | tR(min) | 化合物 | 分子式 | m/z实测值 | δ(ppm) | 碎片离子 | 参考文献 |
| 1 | 0.527 | 蔗糖 | C12H22O11 | 387.116 5 | 6.93 | 341.109 6、179.055 4、161.045 0、119.033 9 | [11] |
| 2 | 1.695 | 1-没食子酸酰葡萄糖 | C13H16O10 | 331.068 2 | 3.76 | 113.023 1 | [11] |
| 3 | 2.096 | 柠檬酸 | C6H8O7 | 191.020 1 | 2.04 | 129.019 1、111.008 5 | [11] |
| 4 | 2.629 | 1-O-β-D-glucopyranosyl paeonisuffrone | C16H24O9 | 405.141 7 | 4.56 | 122.039 3、85.030 5 | [11] |
| 5 | 6.105 | 原儿茶醛 | C7H6O3 | 183.029 9 | 0.03 | 108.985 3 | [13] |
| 6 | 7.238 | 没食子酸 | C7H6O5 | 169.014 5 | 1.34 | 169.015 2、125.023 6、107.012 2 | [11] |
| 7 | 7.856 | 儿茶素 | C15H14O6 | 289.073 3 | 5.03 | 245.081 8、179.034 4 | [11] |
| 8 | 8.915 | 氧化芍药苷 | C23H28O12 | 495.151 7 | 1.79 | 465.142 1、137.023 9、333.097 2 | [11] |
| 9 | 9.526 | 白芍苷R1 | C23H28O11 | 525.163 3 | 3.51 | 121.029 2 | [12] |
| 10 | 10.534 | 芍药内酯苷 | C23H28O11 | 525.163 3 | 3.51 | 449.146 5、165.055 2、121.029 2 | [11] |
| 11 | 12.651 | 芍药苷 | C23H28O11 | 525.163 3 | 3.51 | 449.147 2、327.109 9、165.055 5、121.029 4 | [11] |
| 12 | 13.635 | 异杞柳苷 | C21H22O10 | 433.115 2 | 3.14 | 119.049 4、271.059 3 | [12] |
| 13 | 14.819 | 没食子酰芍药苷 | C30H32O15 | 631.169 2 | 3.11 | 631.168 0、491.119 9、399.093 7、313.057 9、211.028 0、169.013 6 | [13] |
| 14 | 15.623 | 没食子酰芍药苷同分异构体 | C30H32O15 | 631.169 6 | 3.11 | 631.167 6、313.055 7、169.013 2 | [13] |
| 15 | 21.836 | 苯甲酰芍药苷 | C30H32O12 | 629.192 8 | 6.62 | 553.173 3、431.136 3 | [11] |
| 16 | 21.875 | 苯甲酰芍药苷同分异构体 | C30H32O12 | 629.191 8 | 6.62 | 431.137 0、265.072 4、121.029 4 | [13] |
| 17 | 22.736 | 牡丹皮苷B | C31H34O14 | 630.198 8 | 6.30 | 121.029 2 | [11] |
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| 图 1 20批白芍样品指纹图谱 Fig. 1 Fingerprint spectra of 20 batches of Paeoniae Radix Alba |
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| 图 2 20批白芍样品对照图谱 Fig. 2 Reference spectra for 20 batches of Paeoniae Radix Alba |
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| 图 3 正离子模式白芍样品总离子流图 Fig. 3 Total ion current diagram of Paeoniae Radix Alba in positive ion mode |
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| 图 4 负离子模式白芍样品总离子流图 Fig. 4 Total ion current diagram of Paeoniae Radix Alba in negative ion mode |
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| 图 5 20批白芍样品相似度 Fig. 5 Similarity of 20 batches of Paeoniae Radix Alba |
随着雷公藤浓度的升高，细胞存活率逐渐下降，其中，450 μg/mL浓度的细胞存活率为18.36%±2.84%，与NC组相比差异显著（P＜0.01），结果见表 3。
| 组别 | n | 细胞存活率(%) |
| NC组 | 3 | 99.65±2.18 |
| 雷公藤组(28.13 μg/mL) | 3 | 96.69±3.54* |
| 雷公藤组(56.25 μg/mL) | 3 | 68.71±4.05* |
| 雷公藤组(112.5 μg/mL) | 3 | 52.76±2.37** |
| 雷公藤组(225 μg/mL) | 3 | 37.95±3.49* |
| 雷公藤组(450 μg/mL) | 3 | 18.36±2.84** |
| 雷公藤组(900 μg/mL) | 3 | 5.36±3.23* |
| 注：与NC组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。 | ||
20批白芍对HepG2细胞存活率的影响，与NC组比较，雷公藤组细胞的存活率显著降低（P＜0.05）；与雷公藤组比较，白芍联用组细胞存活率均出现显著的升高（P＜0.05或P＜0.01）。见表 4。
| 组别 | n | 细胞存活率(%) | 组别 | n | 细胞存活率(%) | 组别 | n | 细胞存活率(%) | ||
| NC组 | 3 | 99.88±3.02 | S7-雷公藤组 | 3 | 93.32±3.22## | S15-雷公藤组 | 3 | 64.80±2.62## | ||
| 雷公藤组 | 3 | 13.86±4.03* | S8-雷公藤组 | 3 | 94.40±3.15## | S16-雷公藤组 | 3 | 67.10±2.87# | ||
| S1-雷公藤组 | 3 | 76.15±2.64## | S9-雷公藤组 | 3 | 91.31±2.77# | S17-雷公藤组 | 3 | 58.12±3.09## | ||
| S2-雷公藤组 | 3 | 91.74±3.08# | S10-雷公藤组 | 3 | 77.66±3.52## | S18-雷公藤组 | 3 | 42.39±4.06## | ||
| S3-雷公藤组 | 3 | 90.88±2.59## | S11-雷公藤组 | 3 | 53.81±3.61## | S19-雷公藤组 | 3 | 63.43±3.24## | ||
| S4-雷公藤组 | 3 | 73.13±4.07# | S12-雷公藤组 | 3 | 44.97±4.59# | S20-雷公藤组 | 3 | 67.67±2.89# | ||
| S5-雷公藤组 | 3 | 81.97±3.16# | S13-雷公藤组 | 3 | 66.45±4.33## | |||||
| S6-雷公藤组 | 3 | 89.73±4.13# | S14-雷公藤组 | 3 | 51.51±3.77## | |||||
| 注：与NC组比较，*P＜0.05；与雷公藤组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。 | ||||||||||
根据GRA结果，峰1~17均与细胞存活率相关，关联度为0.723~0.835。其中，6个峰（峰10、8、11、15、5、6）的关联度大于0.8，见表 5。提示它们与白芍减轻雷公藤肝毒性的相关性较强。
| 关联序 | 峰号 | 关联度 | 关联序 | 峰号 | 关联度 | |
| 1 | 10 | 0.835 | 10 | 14 | 0.768 | |
| 2 | 8 | 0.824 | 11 | 1 | 0.762 | |
| 3 | 11 | 0.819 | 12 | 4 | 0.756 | |
| 4 | 15 | 0.812 | 13 | 16 | 0.745 | |
| 5 | 5 | 0.803 | 14 | 7 | 0.739 | |
| 6 | 6 | 0.801 | 15 | 12 | 0.734 | |
| 7 | 17 | 0.785 | 16 | 2 | 0.728 | |
| 8 | 3 | 0.779 | 17 | 9 | 0.723 | |
| 9 | 13 | 0.773 |
根据PCA结果，峰10、11、15与细胞存活率显著正相关（P＜0.01），此外峰3~9、13、17呈正趋势，峰1、2、12、14、16与细胞存活率呈负趋势，差异均无统计学意义。推测峰10、11、15为潜在较强减毒活性成分。见表 6。
| 共有峰 | 相关性 | 共有峰 | 相关性 | |
| 1 | -0.123 | 10 | 0.689** | |
| 2 | -0.456 | 11 | 0.678** | |
| 3 | 0.278 | 12 | -0.378 | |
| 4 | 0.234 | 13 | 0.345 | |
| 5 | 0.367 | 14 | -0.189 | |
| 6 | 0.445 | 15 | 0.556** | |
| 7 | 0.189 | 16 | -0.267 | |
| 8 | 0.456 | 17 | 0.378 | |
| 9 | 0.234 | |||
| 注：**P＜0.01。 | ||||
分析结果表明，模型参数R2X、R2Y和Q2分别为0.739（> 0.5）、0.982（> 0.5）和0.922（> 0.4），表明模型具有较准确的预测性。经200次置换检验验证，OPLS-DA模型的Q2回归线与纵轴交点低于0，提示模型未发生过拟合，证实该模型具备良好可靠性，见图 6。由图 7可知，峰2~3、峰5~11及峰13~17的回归系数为正，表明这些共有峰与减轻雷公藤肝毒性作用呈正相关[14]；峰1、4、12的回归系数为负，表明这些共有峰与减轻雷公藤肝毒性作用呈负相关。通常认为，变量重要性投影值（VIP）大于1的自变量对因变量具有显著解释作用[15]。由图 8可知，回归系数为正且VIP值> 1的色谱峰共5个，按回归系数由大到小依次为峰10 > 峰8 > 峰15 > 峰6 > 峰11，表明这5个共有峰对减轻雷公藤肝毒性均有显著影响。
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| 图 6 OPLS-DA模型200次置换检验 Fig. 6 The 200-replacement test of the OPLS-DA model |
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| 图 7 共有峰与细胞存活率回归系数 Fig. 7 Commom peaks and cell survival rate regression coefficients |
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| 图 8 共有峰VIP值 Fig. 8 Common peak VIP values |
将GRA分析中关联度 > 0.8、PCA分析中与细胞存活率显著正相关、OPLS-DA分析中回归系数 > 0且VIP值> 1的共有峰进行整合[16]，得到重叠的共有峰5个，分别为峰6（没食子酸）、8（芍药苷）、10（芍药内酯苷）、11（芍药苷）、15（苯甲酰芍药苷），表明它们与减轻雷公藤肝毒性相关性强，用于后续实验研究。
3.5 潜在减毒活性成分的药效验证 3.5.1 活性成分对HepG2细胞存活率的影响CCK8实验数据结果表明：与NC组细胞相比，TP组随着浓度的升高，细胞存活率逐渐降低（P＜0.05或P＜0.01），见表 7。将0.4 mg/mL作为TP的作用浓度与白芍中的5个活性成分联用，由表 8可知，联用组HepG2细胞存活率相较于TP组显著升高（P＜0.05或P＜0.01），其中1∶1 500为最佳联用比例。
| 组别 | n | 细胞存活率(%) |
| NC组 | 3 | 99.65±2.18 |
| TP组(0.000 4 mg/mL) | 3 | 63.47±3.54* |
| TP组(0.004 mg/mL) | 3 | 60.32±4.05* |
| TP组(0.04 mg/mL) | 3 | 56.32±2.37** |
| TP组(0.4 mg/mL) | 3 | 37.95±3.49* |
| TP组(0.8 mg/mL) | 3 | 15.36±2.84** |
| 注：与NC组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。 | ||
| 组别 | n | 配伍比例 | 细胞存活率(%) |
| TP组 | 3 | - | 33.13±2.58 |
| TP+SYG组 | 3 | 1:500 | 36.23±1.56 |
| 3 | 1:1000 | 64.36±3.09* | |
| 3 | 1:1500 | 86.59±4.56** | |
| 3 | 1:2000 | 89.58±2.67* | |
| 3 | 1:2500 | 91.26±4.65* | |
| TP+SYNZG组 | 3 | 1:500 | 39.66±2.87 |
| 3 | 1:1000 | 52.51±3.42* | |
| 3 | 1:1500 | 90.36±2.87** | |
| 3 | 1:2000 | 88.68±5.02* | |
| 3 | 1:2500 | 83.56±3.56* | |
| TP+MSZS组 | 3 | 1:500 | 37.28±3.32 |
| 3 | 1:1000 | 65.27±2.89* | |
| 3 | 1:1500 | 90.25±2.85* | |
| 3 | 1:2000 | 92.35±3.67* | |
| 3 | 1:2500 | 93.31±4.28* | |
| TP+BJXSYG组 | 3 | 1:500 | 30.37±4.37 |
| 3 | 1:1000 | 66.63±3.86* | |
| 3 | 1:1500 | 89.68±2.58* | |
| 3 | 1:2000 | 83.27±5.04* | |
| 3 | 1:2500 | 89.84±4.37* | |
| TP+YHSYG组 | 3 | 1:500 | 38.32±2.51 |
| 3 | 1:1000 | 58.19±1.97** | |
| 3 | 1:1500 | 90.54±2.08* | |
| 3 | 1:2000 | 82.51±3.06* | |
| 3 | 1:2500 | 85.32±4.25* | |
| 注：与TP组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。 | |||
从图 9可以看出，NC组HepG2细胞边界清晰，结构完整，多连成片状贴壁生长；TP组细胞稀疏，上清中出现较多悬浮细胞，细胞出现皱缩，边界模糊；联用后，细胞数明显增多，状态恢复正常。说明通过联用降低了TP造成的细胞毒性。
|
| 图 9 联用前后细胞形态 Fig. 9 Cell morphology before and after combined treatment |
当肝细胞变性或坏死损伤时，肝细胞内的AST和ALT含量均升高[17]，因此检测了联用前后HepG2细胞的AST及ALT含量。结果显示，TP组HepG2细胞内AST、ALT含量相较NC组中的显著增加（P＜0.05或P＜0.01）；而5个联用组HepG2细胞内AST、ALT含量相较TP组的显著下降（P＜0.05或P＜0.01），见表 9，表明这5个成分可以减轻TP产生的肝损伤。
| U/L | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | n | ALT | AST | ||||||||||||||||||||||||||
| NC组 | 3 | 1.72±0.35 | 1.58±0.22 | ||||||||||||||||||||||||||
| TP组 | 3 | 5.88±0.26** | 6.13±0.34* | ||||||||||||||||||||||||||
| TP+SYG组 | 3 | 1.98±0.17# | 1.82±0.27# | ||||||||||||||||||||||||||
| TP+SYNZG组 | 3 | 2.03±0.41# | 1.75±0.38# | ||||||||||||||||||||||||||
| TP+MSZS组 | 3 | 1.79±0.24# | 2.15±0.45## | ||||||||||||||||||||||||||
| TP+BJXSYG组 | 3 | 2.25±0.19## | 1.86±0.16# | ||||||||||||||||||||||||||
| TP+YHSYG组 | 3 | 1.63±0.52# | 1.97±0.29## | ||||||||||||||||||||||||||
| 注：与NC组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与TP组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。 | |||||||||||||||||||||||||||||
本研究综合运用GRA、PCA与OPLS-DA3种统计模型，结合UPLC-Q-TOF-MS指纹图谱与HepG2细胞存活率药效指标，对白芍中潜在减轻雷公藤肝毒性的主要活性成分进行了筛选。GRA结果显示，白芍指纹图谱中17个共有峰均与HepG2细胞存活率显著相关，其中没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷和苯甲酰芍药苷关联度均高于0.8，表明其可能为白芍联用减轻雷公藤肝毒性的主要活性成分。PCA进一步明确芍药内酯苷、芍药苷与苯甲酰芍药苷与HepG2细胞存活率呈显著正相关（P＜0.01）。OPLS-DA模型通过回归系数与变量重要性投影（VIP > 1）量化各成分贡献，确认上述5种成分对减轻雷公藤肝毒性具有显著正向影响。这种多模型交叉验证策略，有效整合了不同分析方法在关联强度、方向性和贡献量化上的互补优势，提升了从复杂中药体系中辨识活性成分的可靠性与准确性[18]。体外HepG2细胞实验表明，经上述实验筛选得到的白芍中5种活性成分均能明显改善由TP引起的细胞形态损伤，逆转TP所致的HepG2细胞存活率下降，降低HepG2细胞上清液中ALT和AST的含量，以上研究提示，没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷和苯甲酰芍药苷具有较好的肝保护作用，可能为白芍联用减轻雷公藤肝毒性的主要活性成分。
本研究验证的5种成分均属于白芍中已知的单萜苷类及酚酸类成分，其中，没食子酸具有抗氧化和抗炎的作用，已有研究显示其可能通过清除自由基、抑制炎症通路达到减轻四氮化碳（CCl4）所致小鼠急性肝损伤的作用[19]。白芍总苷是白芍提取物中的有效部位，主要包括芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷等成分[20]。贾岚等[21]证实白芍总苷能下调肝阴虚大鼠肝组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素-6（IL-6）水平，提示其通过改善细胞因子紊乱、抑制炎症反应发挥保肝功效。MA等[22]发现，芍药苷可降低非酒精性脂肪性肝炎大鼠血清ALT、AST、总胆固醇（TC）、低密度蛋白（LDL）及TNF-α水平，改善肝脂肪变性与炎症，抑制CD68、转化生长因子-β（TGF-β）表达，其肝保护作用与调控Rho相关蛋白激酶（ROCK）、核因子-кB（NF-кB）通路相关。HU等[23]构建大鼠肝纤维化模型发现，芍药苷能减轻肝损伤及胶原沉积，降低肝羟脯氨酸含量和TGF-β、透明质酸、胶原蛋白Ⅲ型和层粘连蛋白水平，下调Smad 3/4、上调Smad 7表达，通过调节TGF-β/Smads通路发挥抗肝纤维化作用。周雅婷等[24]结合转录组学证实，芍药内酯苷可通过调控色氨酸、磷酸肌醇及癌症胆碱代谢等关键通路以及缓激肽受体B1（BDKRB1）、微管蛋白α8（TUBA8）、肾上腺素能受体1（ADRB1）、谷氨酸代谢型受体1（GRM1）等基因的表达发挥抗肝癌的作用。有研究表明，苯甲酰芍药苷为高选择性的有机阳离子转运蛋白1抑制剂，该化合物能通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）通路并下调乙酰辅酶A羧化酶（ACC）和脂肪酸合成酶（FASN）等脂质合成基因，有效抑制肝细胞脂质沉积，有望应用于脂肪肝疾病的治疗[25]。
同时本研究也存在一些局限性。其一，本研究选用的HepG2细胞虽保留正常肝细胞核心代谢功能，且具有培养稳定、重复性好等优势，是中药肝毒性评价的常用体外模型[26-28]，但作为肝癌细胞系，其肿瘤细胞特性导致部分代谢通路、酶活性及信号传导机制与正常肝细胞存在差异，可能在一定程度上影响肝毒性及保肝作用评价的临床相关性；其二，实验所用20批白芍药材虽涵盖安徽、四川、广东3个产地及3~5年生长年限，但未纳入浙江杭州、山东菏泽等主产区，也未涉及赤芍等相关品种，且未包含2年生样品，可能影响筛选出的活性成分在不同来源白芍中的普适性[29]；其三，毒性诱导剂仅采用TP作为单一模型，TP虽是雷公藤明确的核心肝毒性成分，相关肝损伤机制研究透彻[30-31]，但雷公藤中还含有雷公藤内酯酮、雷公藤红素等多种潜在肝毒性成分[32]，这些成分可能通过协同作用加剧肝损伤且毒性机制存在差异，单一TP诱导剂难以完全模拟雷公藤药材或制剂的整体肝毒性特征，可能导致筛选出的活性成分对雷公藤整体提取物的减毒效果不及对单一TP的减毒效果；其四，本研究仅通过细胞存活率测定、细胞形态观察及ALT和AST含量检测证实了白芍中5种活性成分的减毒作用，未深入解析其具体分子机制，雷公藤肝毒性涉及氧化应激、线粒体功能障碍、炎症通路激活、细胞凋亡等多个环节[33-34]，白芍活性成分可能通过多靶点、多途径协同发挥保护作用，相关调控的具体信号通路仍需进一步探究。因此，本实验后续将采用体内动物模型进一步验证白芍及5种活性成分对雷公藤总提取物所致肝损伤的保护作用，结合转录组学、蛋白质组学等多组学技术系统阐明白芍活性成分拮抗雷公藤肝毒性的分子机制，同时扩大样品收集范围，考察不同产地、年限白芍中关键减毒成分的含量变化规律，为优质白芍药材的遴选与质量控制提供更全面的数据支撑。
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