造影剂诱导的急性肾损伤（CI-AKI）或造影剂肾病（CIN）定义为接受碘造影剂后72 h内血清肌酐（SCr）水平较基线升高超过26.5 μmol/L或大于基线值的1.5倍^[1]。由于造影剂生产工艺进步及新型造影剂研发的逐年进展，其肾脏毒性已较前明显下降，但随着增强CT、CT血管造影以及血管造影和血管内介入治疗在临床应用中的不断增加，CI-AKI的发病率仍持续升高，许多临床医师目前缺乏对造影剂诱导的急性肾损伤的认识以及预先进行风险评估的意识。造影剂诱导的急性肾损伤是继缺血性肾损伤和药物性肾损伤之后院内获得性急性肾损伤的第3大病因^[2]。CI-AKI的病理生理机制目前尚未完全阐明，活性氧（ROS）的产生和继发的氧化应激损伤在CI-AKI的发病机制中起重要作用^[3]。此外，肾脏血流动力学改变引起的肾脏低灌注、肾髓质缺氧缺血以及造影剂本身的细胞毒性作用等同样参与CI-AKI的发病机制^[4]。抗氧化剂治疗和预防造影剂诱导的急性肾损伤是研究的重点方向。银杏叶提取物（EGB）广泛应用于脑血管疾病的治疗，其主要有效成分为银杏黄酮类化合物和银杏内酯类化合物^[5]。作为一种自由基清除剂，EGB的作用机制主要表现在抑制细胞过氧化反应和减轻自由基对机体的损伤，除此之外，EGB还可以通过调节前列环素和内皮舒张因子的生成起到改善血流动力学的作用，因此常被用于减轻缺血再灌注损伤。先前的研究表明，EGB可以通过激活核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路减轻糖尿病肾病大鼠氧化应激损伤^[6]。除此之外，在动物模型中，EGB对顺铂、阿霉素、敌草快等药物引起的急性肾损伤具有一定的保护作用^[7-9]。EGB能否减轻CI-AKI大鼠模型的肾损伤目前尚不明确，因此本实验的目的在于探讨EGB治疗对CI-AKI大鼠的肾脏保护作用以及可能的作用机制。

1 材料与方法 1.1 动物

24只SPF级SD大鼠，8~10周，体质量300~400 g，购自济南朋悦动物繁殖有限公司。动物饲养环境26 ℃，相对湿度50%~60%，光照时间12 h/d，自由饮水进食。动物实验经青岛大学附属医院伦理委员会批准，伦理编号为AHQU-MAL20250523BR。

1.2 药物与试剂

吲哚美辛（Indometacin，上海麦克林生化科技股份有限公司）；左旋硝基精氨酸甲酯（L-NAME，上海麦克林生化科技股份有限公司）；碘克沙醇注射液（Iodixanol，GE Healthcare Ireland Limited）；银杏叶提取物滴剂（Extract of Ginkgo Biloba，Dr.Willmar Schwabe Gmbh & CO.KG）；SCr、尿素氮（BUN）、氧化应激标志物超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 实验分组与处理

24只SD大鼠随机分为假处理组（Sham组）、银杏叶提取物组（EGB组）、模型组（CIAKI组）、银杏叶提取物+模型组（EGB+CIAKI组），每组各6只大鼠。各组大鼠禁食禁水12 h后按照先前文献所述构建大鼠造影剂诱导的急性肾损伤模型^[10]，CIAKI组与EGB+CIAKI组经腹腔注射前列腺素合成酶抑制剂吲哚美辛（10 mg/kg），15 min后经腹腔注射一氧化氮合成酶抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯（10 mg/kg），等待30 min后通过腹腔注射碘克沙醇（10 mL/kg，约3 g碘/kg），Sham组和EGB组依次腹腔注射同等剂量的生理盐水。EGB+CIAKI组与EGB组在诱导模型前给予银杏叶提取物（25 mg/kg，与生理盐水混合成4 mL灌胃），给药剂量按照实验动物与人体间的等效剂量换算公式计算，Sham组与CIAKI组给予等量生理盐水灌胃。

1.4 动物处理及样本采集

造模后24 h，使用异氟烷麻醉后，沿腹壁正中做切口，暴露腹腔并经腹主动脉采血，血清样本在4 ℃下以离心半径150 mm，3 000 r/min离心20 min，取上清液在-80 ℃下冻存等待分析。采血后迅速分离双侧肾脏，将肾脏包膜去除，称量双侧肾脏后迅速置于10%中性福尔马林中固定等待进一步分析。

1.5 血清生化检测

肾功能检测指标血清SCr、BUN、MDA、SOD、CAT、GSH-px、T-AOC分别按照试剂盒说明书的步骤进行检测。

1.6 组织病理切片HE染色及肾小管损伤评分

大鼠肾脏离体后首先称量双侧肾脏质量，后将双侧肾组织经10%福尔马林溶液固定24 h后常规石蜡包埋切片。HE染色：肾组织切片依次进行石蜡溶解、脱蜡、梯度水化、染核、分化、复染、梯度脱水、透明、封片。在光学显微镜下随机选择10个高倍视野（原始放大倍数×200），其中5个位于肾皮质，5个位于皮质与髓质交界处，根据刷状缘缺失、肾小管扩张、管型形成、肾小管坏死和中性粒细胞浸润程度将肾小管损伤分为6个级别，每个视野从0~5分进行评分，0分：正常；1分：轻度损伤，损伤0%~10%；2分：中度损伤，损伤11%~25%；3分：重度损伤，损伤26%~49%；4分：严重重度损伤，损伤50%~75%；5分：广泛损伤，损伤76%~100%。每张HE染色病理切片10个视野评分的均值为该切片肾小管损伤评分数值^[11]。以上评估均由两名盲法评估者完成。

1.7 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）免疫组化染色

肾脏组织经石蜡包埋后，3 μm厚度切片，60 ℃烤箱烤片2 h；二甲苯浸泡脱蜡3次，每次10 min；梯度乙醇浸泡水化4次，每次5 min；纯水浸泡洗涤3次，每次5 min；将切片放入抗原修复液中，微波梯度加热修复20 min，静置冷却至室温（25 ℃），使用磷酸盐缓冲盐液（PBS）浸泡洗涤3次，每次5 min；每张切片加入3%的H₂O₂阻断内源性过氧化物酶室温孵育15 min，PBS浸泡洗涤3次，每次5 min；滴加5%牛血清蛋白（BSA）封闭液，封闭内源性过氧化物酶活性30 min，PBS浸泡洗涤3次，每次5 min；每张切片滴加一抗，阴性对照使用PBS替代，置入4 ℃冰箱过夜（15 h以上），次日取出，在室温下复温30 min，PBS浸泡洗涤3次，每次5 min；每张切片滴加二抗，37 ℃下静置孵育1 h，PBS浸泡洗涤3次，每次5 min；每张切片滴加二氨基联苯胺（DAB）显色，在显微镜下观察显色程度，控制显色时间3~5 min，自来水冲洗终止反应；苏木素复染3 min，流水冲洗3 min，1%盐酸乙醇分化1~3 s，自来水冲洗后使用PBS返蓝，再次自来水冲洗；梯度乙醇脱水浸泡4次，每次5 min；二甲苯浸泡透明3次，每次10 min；最后中性树胶加封盖玻片。将上述处理的切片拍照保存，在20倍视野下，每张切片随机选择5个视野，运用Image J图像处理软件进行半定量分析，计算阳性细胞单一视野下的面积占比（Percent Area Fraction）做统计分析^[12]。

1.8 统计学方法

使用IBM SPSS 24.0处理及分析所有实验数据，所有定量数据使用均数±标准差（x±s）表示，进行正态分布检验和方差齐性检验，使用2×2析因设计方差分析进行统计学分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 肾功能标志物检测

CIAKI组的SCr和BUN水平高于Sham组，差异有统计学意义（P < 0.001），其中SCr绝对值升高超过5 mg/L且相对值升高超过25%，结果提示造影剂诱导的急性肾损伤模型建立成功。给予银杏叶提取物药物干预后，EGB+CIAKI组与CIAKI组相比SCr水平显著下降（P < 0.001），BUN含量明显下降（P < 0.05），这些结果表示银杏叶提取物预给药可以发挥良好的造影剂诱导的急性肾损伤肾功能改善作用。除此之外，EGB组的SCr和BUN水平较Sham组轻微升高，但结果均无显著差异（P > 0.05），这一结果证实了银杏叶提取物的肾脏安全性。见图 1。

2.2 氧化应激标志物

MDA的水平在CIAKI组中较假处理组显著升高（P < 0.001），而EGB+CIAKI组MDA水平较CIAKI组显著下降（P < 0.01），提示EGB预处理可以减轻CI-AKI大鼠模型的脂质过氧化程度。除此之外，CIAKI组的抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活力显著下降，EGB预处理可以显著增加CI-AKI大鼠模型的SOD和GSH-Px活力（P < 0.05），尽管可以观察到EGB+CIAKI组的CAT活力较CIAKI组升高，但是该差异并未达到显著水平（P > 0.05）。CIAKI组T-AOC活力较假处理组下降（P < 0.01），但是EGB药物治疗对CI-AKI大鼠模型T-AOC活力的影响差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 2A-E。

2.3 脏体比系数

与Sham组相比，CIAKI组大鼠的单侧肾脏质量（g）与每100 g体质量比值显著升高（P < 0.001），结果提示模型组有显著的肾脏水肿。而EGB+CIAKI组该系数与CIAKI组相比虽有降低，但该统计分析结果差异无统计学意义（P > 0.05）。EGB组脏体比系数与Sham组相比差异无统计学意义（P > 0.05），结果提示仅给予EGB药物不会引起正常大鼠的肾脏水肿，见图 2F。

2.4 HE染色

Sham组大鼠肾脏HE染色切片未观察到明显的肾小球、肾小管结构性损伤。CIAKI组大鼠可以观察到典型的造影剂诱导的急性肾损伤肾小管结构性损伤，包括大片肾小管上皮细胞空泡变性，上皮细胞脱落，管腔可见上皮细胞碎片、管型，肾间质可见大量淋巴细胞浸润，病理结果证实CI-AKI模型构建成功^[13]。而EGB药物干预能显著减轻CI-AKI大鼠上述肾小管损伤的程度和病变范围，EGB+CIAKI组肾小管损伤组织学评分值显著低于CIAKI组（P < 0.001）。除此之外，EGB组的肾脏组织结构完整，未观察到明显的肾小球、肾小管结构性改变，这一结论表明EGB并无明显的肾脏损伤作用。见图 3、图 4。

2.5 Caspase-3免疫组化

免疫组化分析结果显示，与Sham组相比，CIAKI组的Caspase-3阳性染色细胞区域显著增加（P < 0.001），EGB+CIAKI组阳性染色细胞数量较CIAKI组显著降低（P < 0.001），Sham组和EGB组可以观察到少许的阳性染色细胞，两组的阳性染色面积之间差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 5、图 6。

3 讨论

近年来，CI-AKI的发病率呈上升趋势，会延长住院时间以及增加住院花费，严重者需行短期肾脏替代治疗，已患有慢性肾功能不全的患者CI-AKI的发病率较肾功能正常的人群显著升高，且接受造影剂后需长期肾脏替代治疗的可能性增加^[14]。CIAKI目前并无针对性的治疗或预防药物，血管内接受造影剂前后的水化治疗是目前唯一公认的预防措施。目前常用的CI-AKI动物模型建立主要通过药物预处理、手术预处理、脱水预处理和基于慢性病等方法^[15]。药物预处理法是目前造影剂诱导的急性肾损伤动物实验中使用最广泛的造模方法，其中最常用的药物预处理方案是在给予碘造影剂前给予前列腺素合成酶抑制剂吲哚美辛和一氧化氮合成酶抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯，这两种药物可以通过减少肾脏血管活性物质和肾脏血流来加强碘造影剂对大鼠肾脏的损伤。药物预处理造模方法的优点在于操作简易迅速，造模成功率高、重复性好，也能相对符合人类临床疾病情况，本实验便使用了该种造模方法。

CI-AKI的机制包括直接的肾小管细胞毒性、肾脏内血管收缩以及活性氧的形成和继发的氧化应激损伤等，所有这些因素都会共同促进肾功能的损伤，其机制尚未完全阐明。血管内输注造影剂可以增加肾脏细胞渗透负荷及血流黏度，导致肾髓质的缺氧缺血，造影剂引起的肾脏血管收缩也可在其中起协同作用。肾髓质的缺氧缺血后继发的肾脏氧化应激、活性氧（ROS）的过度产生被认为是CI-AKI的主要病理生理损伤及发病机制^[16-17]。CI-AKI的病理机制错综复杂，ROS可以使内皮素、腺苷等血管收缩物质的合成增加，并诱导一氧化氮和前列腺素的合成减少，加重血管收缩，引起肾脏微循环功能障碍及肾髓质缺血。ROS产生过多和抗氧化酶活性减低导致炎症反应增加，促进细胞坏死与凋亡。除此之外，肾小管上皮细胞ROS的产生可以诱导线粒体功能障碍，氧化应激的平衡遭到破坏，进一步导致线粒体膜的脂质过氧化、线粒体DNA损伤、自噬等。既往的数十年的研究证明，CI-AKI引起ROS的过度产生主要通过丝裂源活化蛋白激酶（MAPK）、沉默信息调节因子1（SIRT1）、Rho/Rho激酶（ROCK）、Nrf2/血红素加氧酶-1（HO-1）4条信号通路。上述因素共同促进CI-AKI的发病，相互作用，并形成恶性循环。因此，防治CI-AKI的研究也主要围绕上述病理生理机制开展。先前的实验和临床研究结果表明，ROS的产生和继发的氧化应激损伤在CI-AKI的发病机制中起至关重要的作用^[18]。在生物体中，氧化反应和还原反应的过程之间通过氧化还原系统维持平衡，参与DNA合成、酶活性、基因表达等过程，确保细胞的基本功能和完整性。自由基的产生与清除之间的不平衡、ROS过度升高可以引起细胞氧化应激损伤，这些损伤的细胞结构包括蛋白质、脂质和核酸（尤其是DNA分子），导致脂质过氧化的副产物MDA升高。氧化还原系统维持促氧化剂和抗氧化剂活性的平衡，抗氧化系统主要包括还原剂类如维生素C、谷胱甘肽、胡萝卜素、半胱氨酸等，中和ROS的抗氧化酶类如SOD、GPx、CAT等。然而在暴露于碘造影剂后，抗氧化酶的活性显著降低，氧化-抗氧化平衡向氧化应激方向转变导致细胞损伤增加。CI-AKI模型中的氧化应激失衡可以导致DNA损伤和细胞凋亡过程的启动，Caspase是细胞凋亡的关键调节因子，DNA损伤促进凋亡蛋白Caspase-3的激活和表达，引起细胞凋亡并标志着不可逆的细胞程序性死亡过程启动。因此，使用抗氧化剂预防造影剂诱导的急性肾损伤是有研究价值的，先前的多数研究都聚焦于具有抗氧化作用和抗炎作用的药物对于CI-AKI的潜在保护作用。

银杏叶提取物中的活性成分主要为银杏黄酮类化合物和银杏萜内酯类化合物及有机酸类等，这些活性成分共同发挥抗氧化应激、清除自由基、抑制炎症反应激活、拮抗血小板活化因子、营养保护神经、改善微循环、减轻再灌注损伤和调节血脂等生物学作用。Liang等^[7]发现EGB可以显著缓解顺铂诱导的急性肾损伤的肾脏间质纤维化程度，作用机制可能与下调p38 MAPK/转化生长因子（TGF）-β 1和p38 MAPK/缺氧诱导因子（HIF）-1α信号通路抑制细胞凋亡有关。先前的研究表明，EGB可以通过抑制核因子-κB（NF-κB）/视黄醇结合蛋白4（RBP4）信号通路减轻敌草快诱导的大鼠急性肾损伤^[9]。除此之外，在动物模型中EGB可以通过调节磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路及下调TGF-β mRNA和肺腺癌相关转录本1（MALAT1）的肾脏表达减轻甲氨蝶呤引起的肾脏损伤^[19]。本实验首次在大鼠模型中评估EGB对CI-AKI的潜在保护作用，实验结果与先前文献发现的EGB肾脏保护作用一致，结果表明，EGB药物干预可以通过以下方面减轻大鼠造影剂诱导的急性肾损伤：1）减少SCr、BUN等肾脏损伤标志物的升高程度。2）减轻CI-AKI大鼠的肾脏组织病理学损伤程度。3）显著减轻CI-AKI大鼠的氧化应激水平和增加抗氧化酶活性。4）显著减少免疫组化染色凋亡蛋白Caspase-3阳性染色细胞数量。EGB可以显著降低碘造影剂对肾功能指标的影响来预防肾损伤，暴露于碘造影剂后大鼠内源性抗氧化酶活性显著下调，脂质过氧化水平升高，证实氧化应激失衡促进CI-AKI的病理生理进展，而EGB可以一定程度上恢复前述的内源性抗氧化酶活性来提供潜在的肾脏保护作用，继而减轻继发的细胞凋亡和肾脏病理结构损伤。除此之外，本实验设置了EGB组来验证药物的安全性，各项实验结果表明，EGB给药并不会引起血清尿素氮和肌酐的升高和肾脏的病理损伤。实验结果证实了EGB防治CI-AKI的潜力，为疾病的预防提供了新的诊治方向。

本研究也存在不足之处，对于肾损伤标志物，本实验仅验证了血清SCr和BUN的水平，尽管SCr目前仍是诊断急性肾损伤最常用的标准，许多实验已证明新型肾损伤标志物如胱抑素C、肾损伤分子-1（KIM-1）、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）等在急性肾损伤诊断和严重程度评估中也具有良好的敏感性和特异性，未来需要实验测定相关肾损伤标志物进一步评估EGB的CI-AKI保护作用。其次，本实验并没有探索炎症因子的作用，先前的研究已证实促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的表达增加在CI-AKI中起到重要作用，进一步的研究需评估炎症因子在CI-AKI发展中的作用以及EGB药物对炎症反应的作用。除此之外，本实验的结论表明EGB的CI-AKI保护作用可能是通过其抗氧化、减少细胞凋亡的特性，但本实验并未对可能涉及的信号通路做进一步检测，有待后续的实验深入研究EGB对于CI-AKI的具体作用机制。

4 结论

综合上述实验结果发现造影剂给药可以损害肾脏功能并诱导氧化应激损伤；EGB可能通过其抗氧化特性调节氧化应激平衡、增加抗氧化酶活性和减轻激发的肾小管凋亡在CI-AKI大鼠模型中发挥肾脏保护作用。此外，实验结果验证了EGB给药的肾脏安全性。本实验的结果可为寻找潜在的CI-AKI预防药物提供参考。