牛黄咽痛散原方是天津中医药大学第一附属医院耳鼻喉科临床经验方，其由人工牛黄、青黛、冰片、黄柏、蒲黄和甘草片组成。方中人工牛黄清泄热邪，为君药；青黛和冰片清热解毒，凉血止痛，为臣药；黄柏性寒佐助君臣清热解毒，蒲黄性平佐制君臣药物寒凉之性，共为佐药；甘草味甘性平，补脾益气，清热解毒，缓急止痛，调和诸药，为使药。该方具有清热解毒，利咽止痛之功，主要用于治疗肺胃热盛，热毒蕴结所致的咽喉疼痛，咽部干燥，咽部灼热感、牙龈肿痛，口舌生疮等。临床多将方中组成饮片粉碎成细粉，吹于患者喉部。现代研究发现，人工牛黄^[1]、青黛^[2]、冰片^[3]、黄柏^[4]、蒲黄^[5]和甘草^[6]均具有抗炎作用。牛黄咽痛散清热解毒，利咽止痛的作用可能与其抗炎作用相关。散剂具有比表面积大、易吸湿分层和稳定性差的特点，优化制备工艺、建立质量标准可改善粉体混合与稳定性，把控粒度和均匀度，提高制剂质量的均一性和药效的稳定性。因此，课题组根据方中中药的理化性质，对其制备工艺及质量标准进行研究，为临床散剂的制备和质量控制提供依据。本研究参考《中国药典》收录品种“珠黄散”和“安儿宁颗粒”的含量测定方法，以及“青黛”“复方青黛丸”“桂林西瓜霜”、黄柏和蒲黄的鉴别方法，以君药人工牛黄中胆红素为定量指标，以青黛中的靛蓝和靛玉红，黄柏中的盐酸小檗碱，冰片的理化特征，以及青黛和蒲黄的显微特征为定性指标，开展专属鉴别，完成牛黄咽痛散制剂的整体质量控制。

1 仪器与材料 1.1 实验仪器

热风循环烘箱（常州恒干干燥设备有限公司，CT-C-O）；粉碎机（天津市中药机械厂，F200）；槽型混料机（江阴市新诺粉体设备有限公司，型号：XN-20）；水分测定仪（赛多利斯MA150）；恒温水浴锅（HH-S2，巩义市予华仪器有限责任公司）；显微镜（XSP-2CA，上海光学仪器五厂）；薄层色谱成像系统（GOODLOOK-1000，上海科哲生化科技有限公司）；电热鼓风干燥箱（DL-101-1，天津市中环实验电炉有限公司）；高效液相色谱仪（1260 Infinity，Agilent）；色谱柱（Eclipse Plus C18 4.6 mm× 250 mm 5 μm，Agilent）；超声波清洗器（KQ-300DE，昆山市超声仪器有限公司）；万分之一天平（BS 210 S，Sartorius）；十万分之一天平（XS205DU，METTLER TOLEDO）。

1.2 试剂与药品

人工牛黄（湖南迪博制药有限公司，批号230101）；青黛（四川千方中药股份有限公司，批号202302001）；冰片（福建南平青松化工有限公司，批号220406）；黄柏（安国市伊康药业有限公司，230901）；蒲黄（安国圣山药业有限公司，230701）；甘草片（北京盛世龙药业有限公司，2308064）。靛蓝标准品（110716-201612，98.7%，中国食品药品检定研究院）；靛玉红标准品（110717-202106，99.1%，中国食品药品检定研究院）；盐酸小檗碱标准品（110713-202015，85.9%，中国食品药品检定研究院）；胆红素标准品（100077-202009，98.8%，中国食品药品检定研究院）；乙醇（分析纯，天津市鑫铂特化工有限公司），硫酸（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）；香草醛（分析纯，天津市鑫铂特化工有限公司）；三氯甲烷（分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司）；甲醇（色谱纯，北京汇海科仪科技有限公司）；甲苯（分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司）；丙酮（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）；异丙醇（分析纯，天津市鑫铂特化工有限公司）；乙酸乙酯（分析纯，天津市鑫铂特化工有限公司）；氨水（分析纯，天津市鑫铂特化工有限公司）；乙腈（色谱纯，北京汇海科仪科技有限公司）；冰醋酸（分析纯，天津市鑫铂特化工有限公司）。

2 研究方法 2.1 工艺研究 2.1.1 饮片干燥温度与时间的确定

散剂在生产制备过程中易出现润湿、液化等问题，故考虑对本处方中部分药材进行干燥。处方中人工牛黄和冰片的处方量较小，且稳定性欠佳，故对其仅作粉碎处理。根据文献调研结果与各药味所含成分的理化特性，分别考察75、80和85 ℃的干燥效果^[7-9]。每隔0.5 h对物料进行水分检测，以药材水分变化和黄柏的颜色变化为考察指标，确定干燥温度和烘干时间（黄柏饮片的外观色泽变化与小檗碱含量的变化基本保持一致^[10]）。

2.1.2 粉碎工艺技术条件的确定

牛黄咽痛散为局部用散剂，根据《中国药典》四部制剂通则0115散剂项下要求，局部用散剂应为最细粉，且一部凡例中规定，最细粉指能全部通过6号筛（100目），并含能通过7号筛（120目）不少于95%的粉末，故牛黄咽痛散制备过程中均采用120目筛。

按处方量比例称取青黛、黄柏、蒲黄和甘草片，用粉碎机将其粉碎，过120目筛；粗渣再次用粉碎机粉碎，过120目筛，与上述药材粉末混匀。将粉碎前的饮片和粉碎后的粉末进行称质量，以确定粉碎工艺技术条件是否可行。

2.1.3 槽混时间的确定

鉴于本处方中含有贵细药人工牛黄及易挥发性药材冰片，且两者投药量均较小。为保证成品质量稳定可控，优先对其他4味药（青黛、蒲黄、黄柏、甘草片）进行初步混合，之后采用等量递增法，将人工牛黄、冰片与初步混合物进行混合。为确定其混合时间，分别于混合开始后10、20、30、40 min，均匀选取混合设备容器中10个取样点取样（10个取样点应至少分布在混合物料的上、中、下3层及卸料区域，每个取样点至少取3份混合样品，每份样品取4 g，如图 1）。按《中国药典》四部制剂通则0115散剂项下的外观均匀度考察方法对混合结果进行评价，评价后再将选取样品进行胆红素含量测定。

2.1.4 ⁶⁰Co-γ射线辐照剂量的确认

将牛黄咽痛散小试的中间品，平放于辐照箱内。采用辐照装置对牛黄咽痛散进行⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌，灭菌剂量分别为6、8、10 kGy。按照《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）四部通则1105（微生物计数法）和通则1106（控制菌检查法）检查样品微生物。根据《中国药典》四部通则“1107非无菌药品微生物限度标准”的规定，本品微生物限度标准为：需氧菌总数每1 g不得超过10⁴ cfu；霉菌和酵母菌总数每1 g不得超过10² cfu；每1 g供试品中，不得检出大肠埃希菌，耐胆盐革兰阴性菌应小于10² cfu，不得检出金黄色葡萄球菌，不得检出铜绿假单胞菌，每10 g不得检出沙门菌。

2.2 质量标准研究 2.2.1 理化鉴别研究

参考《中国药典》中“桂林西瓜霜”的冰片鉴别方法。取本品适量，进行微量升华，升华物呈无色或白色无定形结晶，加数滴乙醇使溶解，加新配制的1%香草醛硫酸溶液1~2滴。另取不含冰片的阴性样品进行平行试验。

2.2.2 显微鉴别研究

应用显微镜对牛黄咽痛散中青黛和蒲黄的显微特征进行鉴别。

2.2.3 薄层色谱研究 2.2.3.1 薄层色谱条件

1）供试品溶液的制备。①靛蓝、靛玉红：取本品5 g，加三氯甲烷20 mL，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。②盐酸小檗碱：取本品1 g，加甲醇40 mL，60 ℃超声20 min，滤过，滤液浓缩至2 mL，作为供试品溶液。

2）对照品溶液的制备。①靛蓝、靛玉红对照品配制：取靛蓝对照品、靛玉红对照品，加三氯甲烷分别制成每1 mL含1 mg和0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。②盐酸小檗碱对照品配制：取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。

3）阴性对照和对照药材溶液的制备。①靛蓝、靛玉红：称取除青黛药材的其余各药制成的阴性对照粉末5 g，按供试品溶液方法制成青黛阴性对照溶液。②盐酸小檗碱：称取除黄柏药材的其余各药制成的阴性对照粉末1 g，按供试品溶液方法制成黄柏阴性对照溶液。

4）薄层展开条件。①靛蓝、靛玉红：照薄层色谱法（四部通则0502）实验，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-丙酮（5∶4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置日光下检视。②盐酸小檗碱：照薄层色谱法（四部通则0502）实验，吸取上述3种溶液各3 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-异丙醇-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（12∶3∶6∶3∶1）为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。

2.2.3.2 薄层色谱方法学考察

1）专属性考察。①靛蓝、靛玉红：牛黄咽痛散全方在靛蓝、靛玉红对照品相同位置处呈现相同斑点，且对应阴性样品无干扰，专属性良好。②盐酸小檗碱：牛黄咽痛散全方在盐酸小檗碱对照品相同位置处呈现相同斑点，且对应阴性样品无干扰，专属性良好。

2）点样量考察。①靛蓝、靛玉红：选取8、10和12 μL进行点样量考察。结果显示，供试品溶液各点样量靛蓝和靛玉红成分荧光显色清晰，条带分离度良好，阴性无干扰。②盐酸小檗碱：选取3、4和5 μL进行点样量考察。结果显示，供试品溶液各点样量盐酸小檗碱成分荧光显色清晰，条带分离度良好，阴性无干扰。

3）不同温度考察—高温、室温、低温。①靛蓝、靛玉红：各温度条件下，供试品溶液靛蓝和靛玉红成分荧光显色清晰，条带分离度良好，阴性无干扰。②盐酸小檗碱：各温度条件下，供试品溶液盐酸小檗碱成分荧光显色清晰，条带分离度良好，阴性无干扰。

4）不同厂家薄层板考察。①靛蓝、靛玉红：应用不同厂家的薄层板（a：青岛海洋；b：江友；c：默克），供试品溶液靛蓝和靛玉红成分荧光显色清晰，条带分离度良好，阴性无干扰，专属性良好。②盐酸小檗碱：应用不同厂家的薄层板（a：青岛海洋；b：江友；c：默克），供试品溶液盐酸小檗碱成分荧光显色清晰，条带分离度良好，阴性无干扰，专属性良好。

2.2.3.3 3批牛黄咽痛散中试样品验证薄层色谱条件

按照临床处方量扩大倍数，制备3批中试样品（24YTS001、24YTS002、24YTS003）。应用中试样品验证牛黄咽痛散的薄层色谱条件。

2.2.4 含量测定 2.2.4.1 含量测定方法

1）色谱条件与系统适用性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-1%冰醋酸溶液（95∶5）为流动相；柱温控制在40 ℃；检测波长为447 nm。理论塔板数按胆红素峰计算应不低于4 000。

2）对照品溶液的制备：取胆红素对照品适量，避光操作，精密称定，置棕色量瓶中，加三氯甲烷制成每1 mL含5 μg的溶液，即得。

3）供试品溶液的制备：取本品2 g，避光操作，精密称定，置50 mL棕色锥形瓶中，精密加入三氯甲烷20 mL，加上盖子，称定质量，置冰浴中超声处理40 min，放至室温，再称定质量，以三氯甲烷补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液至棕色样品瓶中，即得。

3）测定方法。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定。

2.2.4.2 含量测定方法学考察

1）专属性：制备胆红素对照品溶液，牛黄咽痛散供试品溶液和牛黄咽痛散人工牛黄阴性样品溶液，按照含量测定方法进行测定，结果表明该胆红素测定方法专属性好，见图 2。

2）准确度：取0.8 g牛黄咽痛散粉末，置于50 mL棕色量瓶中，精密量取浓度为2.158 μg/mL的胆红素对照品溶液20 mL，冰水浴超声40 min，补足减失质量，摇匀，取上清液经0.45 μm微孔滤膜滤过，平行6份。按色谱条件，进样测定并计算回收率。样品平均回收率为111.20%，RSD为4.80%。根据2020版《中国药典》9101分析方法验证指导原则，回收率可接受范围为80%~115%，符合规定。

3）精密度。①重复性：制备供试品溶液，平行6份。按色谱条件进样分析，计算指标成分的含量。样品中胆红素含量RSD为4.69%，结果符合规定。②中间精密度：制备供试品溶液，平行6份。按色谱条件进样分析，计算指标成分的含量。样品中胆红素含量RSD为1.82%，结果符合规定。

4）线性：取对照品溶液，精密加入一定量三氯甲烷，配制成浓度分别为48.506、24.280、12.140、6.070、3.035 μg/mL的对照品溶液，按色谱条件进样，以浓度（μg/mL）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行回归分析，绘制标准曲线，计算得线性回归方程。回归方程：Y=30.839 X+7.714，R² =1.000。结果表明，胆红素在3.035~48.506 μg/mL范围内具有良好的线性关系。

5）稳定性：取供试品溶液、胆红素对照品溶液，于0、2、8、12、18、24 h分别进样，记录峰面积，计算指标成分含量。结果表明，胆红素对照品RSD为1.80%，供试品溶液RSD为0.70%，样品溶液在室温下24 h内保持稳定。

6）柱温调整（35、40、45 ℃）：取供试品溶液，在柱温分别为35、40、45 ℃的条件下进样分析。结果表明，结果显示，指标成分的峰面积变化较小，40、45 ℃的色谱峰峰型较好；而柱温为35 ℃时，色谱峰出现前沿、拖尾等情况。由此认为，柱温对牛黄咽痛散中胆红素含量测定的影响较大，建议柱温控制在40或45 ℃，以使色谱峰达到最佳分离效果。

2.2.4.3 3批牛黄咽痛散中试样品含量测定

取本品中试样品3批，按照上述色谱条件进行含量测定。

3 实验结果 3.1 工艺研究 3.1.1 干燥温度与时间的确定

最佳烘干温度为80 ℃（75 ℃烘干时间过长，85 ℃颜色变化较重），烘干时间5 h。见表 1。

3.1.2 粉碎工艺技术条件的确定

因多次串打药粉会损耗物料，故对牛黄咽痛散成品率进行考察，以确定该粉碎工艺技术条件的可行性。结果表明该粉碎工艺技术条件可行。见表 2。

3.1.3 槽混时间的确定

结果显示，经槽式混料机混合30 min后，所得粉末色泽均匀，无花纹与色斑，符合《中国药典》对散剂的外观要求，见表 3。且10个取样点的胆红素含量也符合均匀性的要求，见表 4。

3.1.4 60 Co-γ射线辐照剂量的确认

结果表明，未灭菌的和6 kGy辐照剂量灭菌后的牛黄咽痛散微生物超限度，8、10 kGy辐照剂量灭菌后的牛黄咽痛散微生物限度检查均合格，见表 5。根据国家药品监督管理局审评中心发布的《中药辐照灭菌技术指导原则》，中药⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌的剂量应不高于10 kGy。因此课题组确定牛黄咽痛散⁶⁰Co-γ射线辐照较佳的剂量为8 kGy。

3.2 质量标准研究 3.2.1 冰片的鉴别

结果显示，牛黄咽痛散样品显紫色至紫红色。不含冰片的阴性样品未见显色反应，呈负反应。表明该鉴别方法具有专属性，见图 3。

3.2.2 青黛和蒲黄的鉴别

牛黄咽痛散全方样品中显著的显微特征有：不规则块片或蓝色颗粒（青黛）；花粉粒类圆形或椭圆形，表面有网状雕纹，周边轮廓线圆滑，呈凸波状或齿轮状（蒲黄）。见图 4。

3.2.3 薄层色谱研究

经中试3批验证，供试品条带处，在对照品靛蓝、靛玉红和盐酸小檗碱条带相应的位置上，显示相同颜色的斑点，阴性对照的条带处无斑点显现；斑点清晰，分离度高，可用于牛黄咽痛散的薄层鉴别，结果见图 5、图 6。

3.2.4 胆红素含量测定

取本品中试样品3批，按照上述色谱条件进行含量测定。结果表明，胆红素在3.035~48.506 μg/mL范围内具有良好的线性关系。中试3批牛黄咽痛散样品中胆红素的含量为47.30~53.52 μg/g，平均含量为50.62 μg/g。见表 6。

4 讨论

吹喉之法是中医治疗喉部疾病的一种外治方法。临床通常选用具有清热、利咽、祛痰等作用的中药研成极细粉末，用竹管或鹅毛管等直接吹喷于患者咽喉部，以获取相关治疗作用。此种方式在诸多中医医典中均有记载，如《喉科紫珍集》中的二圣散、《白喉症治通考》中的代匙散以及《外科正宗》中的冰硼散等。牛黄咽痛散早期就是参照以上方法，给予患者使用。此种用药方式虽然简单，但缺乏现代化的制剂工艺和质量标准对其进行把控，限制了其质量的均一性和药效的稳定性。为更好服务患者，课题组按照历史使用方法，选取制剂研发备案制路径，参照中成药黏膜溃疡散现代化使用方式，以院内制剂形式定方生产，将其投入临床使用。

本研究对牛黄咽痛散的制备工艺和质量标准进行了研究，牛黄咽痛散的主要制备工艺为：青黛、黄柏、蒲黄和甘草片80 ℃常压干燥5 h，粉碎成最细粉，过120目筛，兑入冰片、人工牛黄最细粉，混合30 min，过120目筛，⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌（8 kGy），分装，即得。由于备案制路径只能应用传统工艺，故课题组选取了常压干燥方式对处方中的饮片进行干燥。但是随着温度的升高和时间的延长，无法避免有效成分的变化。若后续考虑优化其制备工艺，可以考虑其他类型的干燥方式，以控制其有效成分的变化。课题组应用⁶⁰Co-γ射线对牛黄咽痛散进行了辐照灭菌，射线对其有效成分或射线敏感成分含量的影响如何，需要后续进行深入的探讨。

牛黄咽痛散处方共6味药，质量标准涵盖了其中5味，覆盖范围广泛，并且具备操作简单，成本低廉的特点。课题组对处方中青黛和蒲黄进行了显微鉴别研究；对青黛和黄柏进行了薄层色谱条件的摸索；采用HPLC对处方中的君药（人工牛黄）中有效成分胆红素进行含量测定研究；采用理化鉴别法对样品中的冰片进行鉴别。以上所用方法，对仪器设备要求相对不高，满足院内制剂小批量生产、多批次检验和检测成本低廉的实际生产需要。制剂的质量也得到了控制。若后续规模工业化生产，需要对其质量控制方法进一步提升，可增加牛黄咽痛散中其他指标成分含量的测定，应用指纹图谱对其质量控制标准进行提升。

5 结语

综上所述，牛黄咽痛散制备工艺和质量标准研究重复性好，专属性强，能够很好地控制牛黄咽痛散的质量。后续可在临床积累人用经验，对其进行转化研究。