川芎为伞形科藁本属植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，当归为伞形科当归属植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，两者均为著名的活血化瘀药，然而功效各有所长^[1]。川芎“活血行气”，被誉为是“血中之气药”，既能活血化瘀，又能行气止痛^[2]，而当归“补血活血”，被誉为是“血中之圣药”，既能补血调经，又能润肠通便^[3]。川芎和当归挥发性成分具有相似性，均包含类型丰富的苯酞类成分及阿魏酸类成分。药理研究表明苯酞类成分主要具有抗凝血和抗血栓、血管舒张、促进血管生成等作用，阿魏酸类成分主要有抗血栓和抗凝血、保护缺血再灌注损伤等作用，是川芎、当归活血化瘀功效的主要物质基础。

超临界流体萃取法（SFE）更适合苯酞类挥发性成分的提取，在相同川芎药材SFE提取物中苯酞类成分占比97%，而水蒸气蒸馏提取物中苯酞类成分仅为61%^[4]。阿魏酸及阿魏酸松柏酯是川芎、当归挥发性成分分析中的难点，常用的气相色谱质谱联用法（GC-MS）很难检测到其提取物中的阿魏酸^[5]；阿魏酸松柏酯可降解成阿魏酸，采用常规的溶剂提取、溶解时降解程度差异大，增加了其检测难度^[6]。目前为止，仅有高效液相色谱法（HPLC）可同时测定川芎和当归SFE提取物中的苯酞类成分及阿魏酸、阿魏酸松柏酯的含量^[6]，但该方法分析周期长（75 min），供试品提取、溶解方法复杂。综上，探索适合小批量、多批次药材的提取方法，建立更快速、高效的定量分析方法仍然是川芎、当归药材质量控制中亟待解决的问题。超高效合相色谱法（UPC²）相较于GC和HPLC，既能分析难挥发、遇热不稳定样品，又具有选择性高、分析速度快、绿色环保的优点^[7]；有研究采用UPC²同时进行当归中4种苯酞类成分的含量检测^[8]，在不同产地的川芎特征图谱研究中，指认的共有峰除苯酞类成分也包含了阿魏酸^[9]。因此，本文优化了少量多批次药材挥发性成分的超临界流体色谱（SFC）提取方法，建立了基于UPC²的川芎、当归指纹图谱和多成分含量测定方法，比较了川芎和当归主要挥发性成分的差异，以期为完善川芎和当归的质量控制方法、揭示两者活血功效差异的物质基础提供实验依据。

1 仪器与材料 1.1 仪器

超临界流体色谱仪、Waters ACQUITY UPC²超高效合相色谱仪（美国Waters公司）；XS 205 DU型十万分之一天平（瑞士Mettler公司）；旋转蒸发仪（日本EYELA）；氮吹仪MTN-2800W（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；SD-5200 DTS型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；涡旋振荡器（Labnet International公司）。

1.2 试药

甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；甲酸（色谱纯，美国ACS化学）；二氧化碳（食品级，纯度≥99.99%，天津市军粮城常福气体有限公司）。洋川芎内酯I（批号：PS012579）、阿魏酸（批号：PS012219）购自成都普思生物科技股份有限公司；阿魏酸松柏酯（批号：WP24112004）、洋川芎内酯H（批号：WP23102608）、欧当归内酯A（WP24070802）购自四川省维克奇生物科技有限公司；藁本内酯（自制，纯度≥96%）、洋川芎内酯A（自制，纯度≥ 98%）。

1.3 药材

川芎和当归药材来源见表 1，经天津中医药大学李天祥教授鉴定为伞形科藁本属植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎和伞形科当归属植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Viridis^® BEH色谱柱（3.0×100 mm，130 A，1.7 μm），流动相：A为CO₂，B为0.1%甲酸甲醇；梯度洗脱：0~1 min，1.2%B；1.0~2.5 min，1.2%~3.0%B；2.5~12.0 min，3.0%~12.0%B；12.0~12.1 min，12.0%~1.2%B；12.1~15 min，1.2%B；检测波长：280 nm；流速：0.6 mL/min；背压：1 800 psi；柱温：45 ℃；进样体积：1 μL。

2.2 对照品溶液的配制

精密称取藁本内酯、洋川芎内酯A、欧当归内酯A、阿魏酸、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯I适量于2 mL离心管中，加入一定量甲醇，分别配置成藁本内酯24.4 mg/mL、洋川芎内酯A 12.0 mg/mL、欧当归内酯A 2.0 mg/mL、阿魏酸2.0 mg/mL、洋川芎内酯H 0.5 mg/mL、阿魏酸松柏酯10.0 mg/mL、洋川芎内酯I 2.0 mg/mL的各对照品储备液；上述对照品各取100 μL，加甲醇稀释，配制成浓度为藁本内酯2.44 mg/mL、洋川芎内酯A 1.20 mg/mL、欧当归内酯A 0.20 mg/mL、阿魏酸0.20 mg/mL、洋川芎内酯H 0.05 mg/mL、阿魏酸松柏酯1.0 mg/mL、洋川芎内酯I 0.2 mg/mL的混合对照品母液。

2.3 供试品溶液制备

精密称取川芎、当归药材粉末（过50目筛）2.0 g于固体拌样柱，连接到SFC，参照文献方法条件并加以优化^[10]，以甲醇为改性剂，流速为3.5 mL/min，萃取温度40 ℃，背压80 bar，依次以10%、20%、30%、40%、50%甲醇分别提取10 min，每个甲醇浓度间梯度变化的时间为2 min，总提取时间58 min。收集提取液，减压浓缩至一定体积，转移至25 mL容量瓶中，定容即得供试品溶液，进样分析前采用0.22 μm微孔滤膜过滤。

2.4 UPC²指纹图谱的建立 2.4.1 精密度实验

取川芎粉末（L3），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，“2.1”项下色谱条件连续进样6次，以欧当归内酯A（9号峰）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间RSD小于0.22%、相对峰面积RSD小于4.63%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性实验

取川芎粉末（L3），按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，“2.1”项下色谱条件进样，以欧当归内酯A（9号峰）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间RSD小于2.93%、相对峰面积RSD小于4.69%，表明该法重复性良好。

2.4.3 稳定性实验

取川芎粉末（L3），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依次在0、2、6、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样，以欧当归内酯A（9号峰）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间RSD小于0.36%、相对峰面积RSD小于4.87%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.4 川芎和当归指纹图谱的建立

取各批川芎、当归粉末2.0 g，以“2.3”项下方法制备供试品溶液，“2.1”项下色谱条件进样分析；UPC²色谱图以AIA格式导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）软件，分别以L3、A13为参照，中位数法生成川芎（图 1A）、当归（图 1B）药材指纹图谱和对照图谱（R），分别确定了18、11个共有峰，川芎和当归的共有峰有9个（图 1D），通过对照品指认了其中7个共有峰（图 1C），相似度计算结果表明，川芎、当归的化学成分一致性均较高，结果见表 2。

2.5 川芎、当归挥发性成分差异 2.5.1 主成分分析（PCA）

以各批川芎和当归的9个共有峰峰面积为变量导入SIMCA 14.1软件，进行PCA分析。R²X为0.921，Q²为0.684，表明模型可靠，预测能力良好。得分图（图 2A）显示前两个主成分的累计贡献率达到了82.2%，各批川芎和当归化学成分含量差异明显；载荷图中（图 2B），藁本内酯、洋川芎内酯A和阿魏酸松柏酯离原点最远，说明这3个化合物是川芎和当归挥发性成分差异的关键成分。

2.5.2 正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）

在主成分分析的基础上，对数据继续进行OPLS-DA分析。得分图（图 3A）中，川芎和当归差异明显，与PCA结果一致，模型的R²X为0.905，R²Y为0.965，Q²为0.941，证明OPLS-DA模型没有过拟合，可靠性高。由图 3B：藁本内酯、洋川芎内酯A和阿魏酸松柏酯的VIP值大于1，是川芎和当归挥发性成分差异的关键成分。

2.6 7个共有成分含量测定 2.6.1 线性关系考察

取“2.2”项下7个对照品母液，依次稀释，“2.1”项下色谱条件进样分析；以对照品浓度X（μg/mL）为横坐标，色谱峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，各成分回归方程和线性范围见表 3。

2.6.2 精密度实验

取川芎粉末（L3），按“2.1”项色谱条件连续进样6次，记录7个化合物色谱峰面积并计算相对标准偏差（RSD）分别为1.34%、0.62%、0.47%、1.06%、1.15%、0.74%、1.99%，表明仪器精密度良好。

2.6.3 重复性实验

取川芎粉末（L3），按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，“2.1”项下色谱条件连续进样，记录7个化合物色谱峰面积并计算相对标准偏差（RSD）分别为1.54%、2.27%、1.54%、2.77%、2.32%、1.58%、2.56%，表明该方法重复性良好。

2.6.4 稳定性实验

取川芎粉末（L3），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依次在0、2、6、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样，记录7个化合物质量分数的RSD分别为0.42%、0.50%、0.57%、1.28%、0.51%、0.37%、2.50%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.6.5 加样回收率实验

取已知含量的川芎粉末（L3）6份，每份1.0 g，按对照品质量与供试品中质量1：1分别精密加入7个对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件连续进样，计算回收率。7个化合物的平均回收率分别为98.86%、106.89%、97.33%、94.28%、106.15%、108.94%、109.04%，RSD分别为4.53%、1.49%、1.04%、3.06%、2.36%、1.92%、0.65%。

2.6.6 含量测定

取各批川芎、当归药材粉末，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，“2.1”项下色谱条件进样分析，按“2.6.1”下标准曲线计算7个化合物含量，结果见表 4、表 5。由表可知：川芎挥发性成分中各化合物含量均高于当归，藁本内酯在川芎（8.36~19.53 mg/g）和当归（1.41~8.90 mg/g）中均为含量最高的化合物；洋川芎内酯A在当归（0.18~0.59 mg/g）中含量较低，川芎（5.36~9.64 mg/g）中较高，与文献报道基本一致^[11]，阿魏酸松柏酯在当归（0.09~0.88 mg/g）中含量较低，川芎（1.18~3.82 mg/g）中较高；该结果与化学模式识别结果一致。

3 讨论 3.1 SFC提取条件的优化

苯酞类成分主要存在于川芎挥发油中，文献表明SFE更适合苯酞类成分的提取^[4]。本研究分别考察了改性剂种类（甲醇、乙腈、乙醇），背压（70、80、90、100、110 bar），温度（30、35、40、45、50 ℃），流速（2.0、3.0、3.5、4.0、4.5 mL/min）对川芎挥发性成分提取率的影响。结果表明以甲醇为改性剂，设置流速为3.5 mL/min，萃取温度40 ℃，背压80 bar，进行梯度提取，川芎挥发性成分的得率最高（11.42±0.32%）。该方法快速、高效、环保，更适合少量多批次的药材提取。

3.2 UPC²色谱条件的优化 3.2.1 色谱柱的选择

为使川芎和当归挥发性成分在尽可能短的时间被检测并兼具良好的峰形，考察了Waters Torus^TM 1-AA（3.0×100 mm，130 A，1.7 μm），Viridis^® BEH（3.0×100 mm，130 A，1.7 μm），Torus^TM 2-PIC（3.0×100 mm，130 A，1.7 μm），Torus^TM DIOL（3.0×100 mm，130 A，1.7 μm），Viridis^® HSS C₁₈ SB（3.0×100 mm，130 A，1.7 μm）五种常见色谱柱对目标化合物的分离影响。结果显示，在UPC²系统中，二者的挥发性物质在Viridis^® BEH（3.0×100 mm，130 A，1.7 μm）色谱柱上具有较好的保留，仅藁本内酯存在一定拖尾，洋川芎内酯A、欧当归内酯A、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯I具有较好的峰形，因此选择Viridis^® BEH（3.0×100 mm，130 A，1.7 μm）色谱柱。

3.2.2 改性剂的选择

通过加入一定种类和比例的改性剂，可以改变超临界CO₂的密度，改善流动相的极性和溶解度。本实验考察了甲醇、乙醇、乙腈3种改性剂对色谱分离的影响。当使用乙醇和乙腈作为改性剂时，藁本内酯或洋川芎内酯A峰形狭窄，响应值过高，导致其他色谱峰不明显；使用甲醇作为改性剂时，各色谱峰分离度较好，响应值适中，因此选用甲醇作为本实验的改性剂。

3.2.3 流速的选择

本实验分别考察了流速为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min对分离效果的影响，当流速为0.4 mL/min，藁本内酯、洋川芎内酯A存在峰展宽，出峰时间过长；流速为1.2 mL/min，各色谱峰分离效果及峰形较差，在保证合适的出峰时间和分离度前提下，最终流速选择0.6 mL/min。

3.2.4 背压的选择

背压调节器通过调节流动相密度，改变流动相对样品的溶解能力，影响出峰。考察了在背压为1 700、1 800、1 900、2 000、2 100 psi对色谱分离的影响。背压升高，各色谱峰出峰时间一定程度上缩短，当背压大于1 800 psi时，洋川芎内酯A为前沿峰；综合适当的出峰时间，最终设定背压为1 800 psi。

3.2.5 柱温的选择

在设定的柱温（30、35、40、45、50 ℃）下，柱温升高，各色谱峰的出峰时间一定程度延长，当柱温在45 ℃时，各色谱峰峰形较好，出峰时间适中，最终以45 ℃作为最佳柱温。

3.3 川芎和当归挥发性成分差异

文献研究表明川芎中主要挥发性成分为藁本内酯，洋川芎内酯A，阿魏酸松柏酯^[13]，当归中主要挥发性成分为藁本内酯，3-丁基苯酞，阿魏酸松柏酯^[12]，文章发现川芎、当归9个共有挥发性成分，其中5个为苯酞类成分。洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、藁本内酯均具有不同程度的凝血酶抑制活性^[13]，因此苯酞类成分是川芎、当归活血功效的共同物质基础。文献研究表明，挥发性成分具有行气开郁的作用，是发挥“行气”功效的物质基础^[14]，文章基于UPC²法分析了当归、川芎的挥发性成分，结果表明无论是数量还是含量，当归均低于川芎，因此川芎在“活血”的同时具有“行气”功效，而当归的“行气”功效表现不明显。根据文献研究，当归的“补血”功效主要来源于多糖等非挥发性成分^[15]，本文研究仅针对“挥发性成分”，其他成分的差异和功效关系有待研究揭示。

本研究通过UPC²建立川芎和当归指纹图谱和7个成分的含量测定方法，对川芎和当归的共有挥发性成分进行定性定量分析，鉴别两种药材中挥发性成分的主要差异成分，可同时检测挥发性成分中的主要苯酞类成分和阿魏酸、阿魏酸松柏酯。建立的方法快速、准确，可为完善川芎和当归的质量控制提供参考。