肝癌是临床最常见和预后最差的恶性肿瘤之一，中国肝癌新发病例约占全球的45%，死亡病例约占全球的47%，其复发率高治疗手段少，严重影响患者的生存期限和生活质量^[1]。早期肝癌的治疗以外科手术为主的综合治疗，中晚期治疗以系统治疗为主要方式，包括基础的对症对因治疗、保肝治疗、分子靶向药物治疗、免疫检查点抑制剂治疗、化学治疗和中医中药治疗等^[2]。传统的抗肿瘤治疗具有不良反应较多、产生免疫耐药等劣势，中医药在治疗肝癌方面具有提高生活质量、延长生存期限、减轻化疗的毒副作用等优势，是中国治疗肝癌方案中特色鲜明的一部分^[3]。

消瘤散（Xiaoliu San，XLS）是上海市名中医吴正翔教授治疗恶性肿瘤的经验方，已获批发明专利^[4]，方中包括太子参、白术、薏米仁、枳实、蛇六谷、漏芦、山慈菇、土鳖虫、急性子、石打穿、石见穿、石上柏、龟甲、鳖甲、墓头回，共奏扶正祛邪，消癥除癌之效。前期在临床和动物模型中，本课题组发现消瘤散有抑制肝癌瘤体生长，延长生存期，改善患者生存质量等疗效^[5-7]。采用基因芯片筛选XLS干预下HepG2细胞中差异基因表达，发现Ras相关的C3肉毒素底物1（Rac1）表达显著降低，提示XLS可通过抑制Rac1的表达抑制肝癌细胞生长^[8]。AKT可通过磷酸化mTOR激活Rac1从而完成细胞的增殖和迁移等活动，在此基础上，笔者课题组探讨XLS对肝癌荷瘤裸鼠模型及肝癌细胞株HepG2生长的抑制作用及其机制。

1 实验材料 1.1 实验动物和细胞系

24只SPF级BALB/c裸鼠购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，体质量20~22 g，实验动物许可证号：SYXK（沪）2020-0009，饲养在SPF级环境中，恒温21~25 ℃，湿度在40%~60%，照明昼夜交替，普通饲料喂养，自由饮水与进食，实验经上海中医药大学动物伦理委员会批准，伦理批号：PZSHUTCM2310080005。人肝癌细胞HepG2购自武汉普诺赛生物科技有限公司（货号CL-0103，传至10~15代）。

1.2 实验药物

消瘤散由太子参15 g，白术9 g，薏苡仁15 g，枳实9 g，石打穿15 g，石见穿15 g，石上柏15 g，炙鳖甲9 g，炙龟甲10 g，土鳖虫10 g，山慈菇10 g，墓头回10 g，漏芦10 g，蛇六谷15 g，急性子10 g组成，委托上海万仕诚药业有限公司制作成冻干粉（批号：20231009），1 g冻干粉等于25.2 g生药。

1.3 实验试剂

DMEM、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液（美国Gibco公司，货号：1868985、10091-148、15140122），细胞凋亡检测试剂盒（上海翌圣生物科技有限公司，货号：40302ES5），蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物、RIPA裂解液（上海碧云天生物科技有限公司，货号：P1045、P0013B），磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抗体、丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）抗体、血小板-内皮细胞黏附分子（CD31）抗体（美国Abcam公司，货号：ab191606、ab8805、ab9498），Rac1抗体（美国Selleck公司，货号：F2364），哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗体、p-AKT抗体（美国CST公司，货号：2972、4060），p-mTOR抗体（中国索莱宝科技有限公司，货号：K006205P），增殖细胞核抗原（Ki-67）抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：28074-1-AP），GAPDH抗体（美国Bioworld公司，货号：AP0063），山羊兔二抗、山羊鼠二抗、CCK-8试剂盒（上海碧云天科技有限公司，货号：A0208、A0216、C0046），免疫组化兔二抗、显色试剂，（上海基因科技有限公司，货号：20240510）。

1.4 实验仪器

AU5821型全自动生化分析仪（美国Beckman Coulter公司）；ASP300S型自动脱水机（德国Leica公司）；EG1150H型石蜡包埋机（德国Leica公司）；RM2235型石蜡切片机（德国Leica公司）；HI1220型烤片机（德国Leica公司）；KF-PRO数字病理扫描仪（宁波江丰生物信息技术有限公司）；MCO-175型细胞二氧化碳培养箱（日本SANYO公司）；细胞小室24孔板套装（上海碧云天生物科技有限公司）；BD FACSCANtoTMⅡ型流式细胞仪（美国BDBioscience公司）；F200PRO型多功能酶标仪（德国Tecan公司）；PowerPac Basic型电泳仪（美国BioRad公司）；4600SF型化学发光成像系统（上海天能科技有限公司）。

2 实验方法 2.1 肝癌裸鼠荷瘤模型制备及分组给药

基于统计功效与收益递减法则，并基于伦理的3R原则，E=总动物数-组数，E值的理想范围是10到20之间，因此取E=20，4组裸鼠，共24只。24只裸鼠适应性喂养1周后，取生长状态良好的HepG2细胞，将基质胶和HepG2细胞以3∶1的体积比混合制成单细胞悬液，以8×10⁶个细胞/只注射100 μL进裸鼠左侧腋窝皮下。14 d后成瘤，游标卡尺测量荷瘤的长径及宽径，待成瘤平均长到14 mm×13 mm，随机分成模型组，消瘤散低剂量组、消瘤散中剂量组、消瘤散高剂量组，每组6只。消瘤散中剂量组按照体表面积等效剂量法进行换算，成人每日消瘤散生药177 g，标准体重按70 kg计，得出成人每公斤体重剂量约为2.53 g/kg，采用中药复方动物实验中常用的简化经验系数10倍，即裸鼠等效剂量为25.3 g/kg，取整为25 g/kg。消瘤散低剂量组和高剂量组则分别取人体等效剂量的1/2和2倍。消瘤散低剂量组予消瘤散12.5 g/kg，中剂量组予消瘤散25 g/kg，高剂量组予消瘤散50 g/kg，灌胃给药14 d，模型组裸鼠灌胃相同体积的生理盐水。

2.2 实验取材

末次给药24 h后将裸鼠取材。记录各组动物的肝脏质量、脾脏质量以及肿瘤体积，将荷瘤切成5 mm×5 mm置入4%的多聚甲醛固定，用以HE染色及免疫组化实验。其余肿瘤组织放入蛋白管保存于-80 ℃冰箱用于免疫蛋白印迹（Western blot）法检测相关蛋白。

2.3 HE染色

将固定72 h后的组织脱水、包埋后切成4 μm的切片，置于70 ℃烤片机40 min后进行脱蜡，水化后进行苏木素染色8 min，清洗、盐酸乙醇分化后返蓝5 min，伊红染色1 min后清洗擦干，干燥后中性树胶封片。

2.4 血生化指标检测

在上海中医药大学附属曙光医院检验科全自动血清生化分析仪上机检测大鼠肝血清的丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBil）、谷氨酰转移酶（GGT）、碱性磷酸酶（ALP）含量。

2.5 免疫组化检测荷瘤Ki-67、CD31

包埋、切片过程同“2.3”项，石蜡切片进行常规脱水脱蜡，清洗后置入0.3%的柠檬酸钠加热以修复抗原，室温冷却后避光置入3%双氧水（H₂O₂）去除内源性过氧化物酶，清洗后滴加10%山羊血清，30 min后滴加一抗4 ℃过夜（Ki-67 1∶500，CD31 1∶1 000）。次日复温30 min，清洗后进行DAB显色，清洗后用苏木素染核，盐酸乙醇分化后水中浸泡返蓝，风干后封片，扫描观察。

2.6 Western blot检测各组荷瘤相关蛋白表达

称取30 mg肿瘤组织，加入600 μL裂解液（RIPA∶蛋白酶磷酸酶抑制剂=50∶1∶1）匀浆，冰上静置后12 000 r/min离心（离心半径8 cm）15 min提取上清。BCA法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液煮沸10 min。配置预制胶后进行蛋白上样，电泳后转PVDF膜，快速封闭液封闭1 h后孵育一抗过夜（Rac1 1∶2 000，AKT 1∶1 000，p-AKT 1∶2 000，mTOR 1∶2000，p-mTOR 1∶500，PI3K 1∶1 000，GAPDH 1∶3 000），次日清洗后孵育二抗1 h（山羊兔二抗1∶1 000，山羊鼠二抗1∶1 000），清洗后滴加显影液显影。

2.7 细胞培养及分组给药

常规复苏传代培养HepG2细胞，待覆盖率约为60%时参照试剂盒操作手册进行逆转录病毒感染，共转染慢病毒Rac1表达质粒并在荧光显微镜下确认转染成功。HepG2-Rac1^OE用于实验。将细胞分为对照组、消瘤散组、Rac1^OE组、Rac1^OE+消瘤散组。消瘤散组和Rac1^OE+消瘤散组给予半抑制浓度（IC₅₀）的消瘤散，其他两组给予等量PBS干预。

2.8 细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测细胞增殖能力

将HepG2细胞接种到96孔板中，每孔接种100 μL约10 000个细胞悬液，过夜后弃培养基，加入含不同浓度药物的新培养基（0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、5.0 mg/8 mL）XLS，每孔100 μL。孵育24 h后，每孔加10 μL CCK8试剂，混匀后37 ℃下孵育2 h，450 nm波长下检测每孔的吸光度。计算细胞存活率并绘制效应曲线，计算IC₅₀，后续细胞功能检测实验采用IC₅₀及相邻浓度作为梯度浓度对照。

2.9 划痕实验检测细胞迁移能力

HepG2细胞接种至6孔板，每孔约5×10⁵个细胞，加入完全培养基培养24 h，吸弃培养基，PBS清洗后加入消瘤散无血清培养基，用200 μL枪头垂直孔板在单层细胞上划一条直线，同一孔内划5条平行线，0、24、48、72 h后倒置显微镜下拍摄划痕区域。

2.10 Transwell法检测细胞侵袭能力

取60 μL稀释到1 mg/mL的基质胶加入Transwell小室中，37 ℃孵育2 h。弃基质胶，上室接种1×10⁵个无血清细胞悬液，下室加入600 μL含不同浓度含药培养基，孵育24 h。弃多余细胞及基质胶，PBS清洗膜表面1次，4%多聚甲醛室温固定30 min。弃固定液并洗涤小室内外，在24孔板加入600 uL结晶紫染色液，将小室放入染色10 min。清洗风干后，显微镜下观察，用Image J计数取平均值进行定量研究。

2.11 流式细胞术检测细胞凋亡能力

取1×10⁵的对数生长期HepG2细胞接种于6孔板中，予消瘤散梯度剂量处理24、48、72 h后，收集细胞，清洗细胞。吸净离心管残余的PBS后，每管加入100 μL的binding buffer，重选后避光加入染料，不染组不加，单染组加Annexin V或PI 5 μL，Annexin V和PI双染组加入Annexin V和PI各5 μL，混匀后室温避光孵育15 min，加入binding buffer 300 μL并混匀转移到5 mL的流式管中，上机检测。

2.12 Western blot检测各组细胞相关蛋白表达

培养的HepG2细胞经预冷的PBS漂洗2次；吸净PBS，加入150 μL预冷的裂解液，用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的离心管中，4 ℃摇动30 min后离心（离心半径8 cm）12 000 r/min、20 min，取上清。BCA法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液煮沸10 min。配置预制胶后进行蛋白上样，电泳后转PVDF膜，快速封闭液封闭1 h后孵育一抗过夜（AKT 1∶1 000，p-AKT 1∶2 000，mTOR 1∶2 000，p-mTOR 1∶500，PI3K 1∶1 000，GAPDH 1∶3 000），次日清洗后孵育二抗1 h（山羊兔二抗1∶1 000，山羊鼠二抗1∶1 000），清洗后滴加显影液显影。

2.13 统计学分析

所得数据用SPSS 26.0进行统计分析，结果以均数±标准差（x±s）表示，两两比较采用t检验，多组之间比较采用单因素方差分析（One Way ANOVA），以P < 0.05表示差异有统计学意义。使用Graphpad Prism9.5绘制IC₅₀曲线，Image J计算划痕实验细胞间距离的均值。免疫组化图片结果用Image J计算阳性细胞数量，Western blot用Image J分析灰度值。

3 实验结果 3.1 动物实验结果 3.1.1 消瘤散对裸鼠一般情况及瘤体生长的影响

与模型组比较，消瘤散中、高剂量组的裸鼠荷瘤体积均减小（P < 0.05）。各组荷瘤鼠的肝脏质量差异无统计学意义。消瘤散高剂量组的脾脏质量较模型组减轻，差异具有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。

3.1.2 消瘤散对裸鼠肝功能的影响

与模型组比较，消瘤散给药组的裸鼠血清的AST、TBil、GGT均显著降低（P < 0.01），ALT和ALP则差异无统计学意义。见表 2。

3.1.3 消瘤散对裸鼠荷瘤病理变化的影响

模型组HE染色可见大量肿瘤细胞，部分细胞呈巢状生长，分裂细胞占比高，未见坏死组织。消瘤散给药组可见肿瘤细胞坏死，其中消瘤散中、高剂量组存在大面积坏死，细胞质疏松，核仁固缩。见图 1。

3.1.4 消瘤散对裸鼠荷瘤Ki-67、CD31表达的影响

Ki-67定位在细胞核，阳性表达为棕色；CD31定位在细胞膜，阳性表达为棕色。与模型组比较，消瘤散高剂量组Ki-67阳性表达降低（P < 0.05），各组间CD31表达比较差异无统计学意义。见图 2、表 3。

3.1.5 消瘤散对裸鼠荷瘤相关蛋白表达的影响

与模型组比较，消瘤散中剂量组的Rac1表达下降（P < 0.01）。消瘤散高剂量组的Rac1、p-AKT、p-mTOR表达下降（P < 0.05），PI3K的表达显著下降（P < 0.01）。见图 3、表 4。

3.2 细胞实验结果 3.2.1 消瘤散对HepG2细胞的IC₅₀

随着给药浓度的增加，细胞存活率下降。根据拟合曲线计算消瘤散对于HepG2的IC₅₀值约1.5 mg/mL。见图 4。后续细胞功能实验采用XLS-L（1.25 mg/mL）、XLS-M（1.5 mg/mL）、XLS-H（1.75 mg/mL）剂量作为梯度对照。

3.2.2 消瘤散对HepG2细胞迁移能力的影响

划痕实验结果如图 5所示。与PBS组相比，XLS-M、XLS-H给药组干预24 h后细胞迁移能力降低（P < 0.05），XLS-M组干预72 h后亦可见细胞迁移能力降低（P < 0.05）。

3.2.3 消瘤散对HepG2细胞侵袭能力的影响

Transwell小室检测HepG2细胞侵袭发现，与单纯给PBS相比，XLS-L、XLS-M、XLS-H给药组HepG2细胞侵袭能力均明显减弱（P < 0.01），且消瘤散浓度越高，侵袭能力越弱。见图 6。

3.2.4 消瘤散对HepG2细胞凋亡的影响

如图 7所示，消瘤散可促进HepG2细胞凋亡，消瘤散浓度越高凋亡细胞的比例越高，XLS-M组即1.5 mg/mL的消瘤散处理72 h的HepG2细胞凋亡率最高（P < 0.01）。

3.2.5 Western blot检测各组细胞相关蛋白表达

Rac1^OE组细胞感染成功后荧光验证见图 8。与对照组相比，消瘤散组的p-AKT表达显著下降（P < 0.01），p-mTOR表达亦下降（P < 0.05）。与Rac1^OE组相比，Rac1^OE+消瘤散组的p-AKT表达下降（P < 0.05），p-mTOR表达显著下降（P < 0.01）。各组的PI3K表达未见显著差异。见图 9、表 5。

4 讨论

肝癌在中医当属“肝癌”“积聚”范畴，肝癌的发病多责之于正气虚损，肝郁脾虚，或肝气郁结，化火伤阴，或气滞血瘀，痰毒蕴结，或气郁湿阻，湿毒内蕴而致^[9]。因此，治疗时多以疏肝健脾、活血化瘀、解毒消癥等方法为主。消瘤散方中太子参、白术、薏米仁、枳实健脾渗湿化痰导滞，蛇六谷、漏芦、山慈姑等消结散瘤，龟甲、鳖甲滋阴补肾祛瘀化癥，以奏健脾益气，消积化癥，直捣癌巢，祛病除癌之效。本课题组前期研究中发现，消瘤散对腹腔实体瘤生长亦具有显著抑制作用，同时可抑瘤固本，减毒增效，提高肝癌患者生活质量，延长其生存时间，从“健脾消癥”角度为肝癌的中医治疗提供切实依据^[5]。

Rac1是细胞内重要的信号转导分子，可调控细胞骨架重组、驱动片状伪足形成，促进内皮细胞向血管生成信号方向迁移，可促进细胞迁移、侵袭和细胞极性建立等关键细胞过程，是调控多种细胞活动和基因表达的信号分子开关^[10]。在肝癌细胞中，Rac1可以被多种上游信号激活，AKT通过mTOR激活Rac1是一个关键的细胞信号传导通路。AKT通过解除mTOR的抑制因子结节性硬化症蛋白复合体2（TSC2），激活其促进因子脑Ras同源蛋白（Rheb）而活化mTOR，磷酸化的mTOR激活特定的Rac1鸟苷酸交换因子结合到细胞膜上的Rac1相应位点，驱动细胞骨架重组和细胞迁移^[11]。AKT是PI3K通路的核心效应分子，肝癌中其过度磷酸化，驱动肿瘤细胞存活、增殖、代谢和抑制凋亡^[12]。

本研究通过构建HepG2荷瘤裸鼠模型明确了消瘤散治疗肝癌的疗效和作用靶点。模型组HE染色可见大量肿瘤细胞，提示造模成功。消瘤散中、高剂量组的裸鼠荷瘤体积减小表明其抑制肿瘤生长。消瘤散给药组裸鼠的AST、TBil、GGT降低表明其可改善肝功能，减轻慢性肝损伤。病理染色提示消瘤散可促进肿瘤细胞坏死。免疫组化结果表明消瘤散可抑制肿瘤细胞增殖，但并无抑制肿瘤细胞血管新生的作用。Western blot结果提示消瘤散的抗肿瘤作用可能是通过抑制PI3K/AKT/mTOR-Rac1通路实现的。细胞实验部分通过检测细胞功能和过表达Rac1进行消瘤散对HepG2细胞株的作用和机制的直观再验证。CCK8、划痕实验、Transwell结果表明消瘤散可抑制HepG2细胞的生存能力、迁移能力和侵袭能力。Annexin V/PI是检测细胞凋亡的准确方式。本研究中流式细胞术结果显示消瘤散可促进HepG2细胞凋亡。Western blot则提示消瘤散可抑制HepG2细胞中AKT和mTOR的表达，对PI3K的作用暂不明显。因此，消瘤散对HepG2细胞的抑制作用可能是通过调控AKT/mTOR-Rac1实现的。这与消瘤散的功效密切相关，扶助正气以调节患者免疫功能，祛邪消癥以限制肿瘤生长。

综上所述，消瘤散可以改善HepG2细胞荷瘤裸鼠的肝功能，抑制荷瘤的生长，促进荷瘤的坏死，降低AKT/mTOR-Rac1通路蛋白表达；消瘤散还可抑制HepG2细胞株的生长，降低其迁移侵袭能力并且促进其凋亡，机制可能与抑制AKT/mTOR-Rac1通路有关。消瘤散对于中晚期肝癌的疗效确切，本研究在此基础上探究其作用机制，为临床提供分子生物学依据，由于肝癌发生发展的机制复杂，涉及庞大的调控网络，因此消瘤散的抗肝癌机制还应进行进一步的实验验证和探索。