2026, Vol. 45文章信息
- 尔佳丽, 张佳钰, 邴湘楠, 赵舒, 杜晨光, 齐峰, 张碧溦, 徐丁洁
- ER Jiali, ZHANG Jiayu, BING Xiangnan, ZHAO Shu, DU Chenguang, QI Feng, ZHANG Biwei, XU Dingjie
- 基于NLRP3炎症小体介导巨噬细胞极化探讨金匮温经汤改善虚寒证大鼠子宫损伤的作用机制
- Mechanism of Jingui Wenjing Decoction in improving uterine injury in rats with deficiency-cold syndrome based on NLRP3 inflammasome-mediated macrophage polarization
- 天津中医药大学学报, 2026, 45(9): 1088-1098
- Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2026, 45(9): 1088-1098
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1673-9043.2026.09.09
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文章历史
收稿日期: 2026-06-05
引用本文 |
寒证为八纲之一，妇科虚寒证是临床较多见的病证之一。根据寒者热之，异病同治的方法，金匮温经汤（简称JGWJD）被选为临床常用方[1-3]。该方见于《金匮要略》妇人杂病脉证并治第二十二，由吴茱萸、当归、川芎、芍药、人参、桂枝、阿胶、牡丹皮、生姜、甘草、半夏、麦冬12味中药组成，“温、清、消、补”四法并用，共奏调养冲任虚寒之功。课题组前期研究显示，虚寒证模型大鼠子宫雌孕激素受体减少，内膜变薄，炎性细胞浸润，并伴有局部水肿[4-5]由上证实虚寒证模型大鼠的病理损伤与子宫炎性微环境改变有关。临床研究同样显示，虚寒证月经病患者生殖内分泌紊乱，机体免疫功能降低，炎性因子表达升高，出现氧化应激，子宫则表现为慢性微炎症状态，进而导致子宫内血流灌注量减少，外周循环阻力增加破坏子宫健康环境，常诱发痛经、不孕、月经后期、子宫内膜异位症等疾病[6-10]。
现代研究发现NOD样受体（NLR）家族含有吡林结构域3（NLRP3）炎症小体参与了多种炎症性疾病的发展过程，其主要由NLRP3蛋白、焦亡相关斑点蛋白及效应蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（caspase-1）三部分组成，且被证实与调节机体巨噬细胞极化分型、减轻炎症反应相关[11-14]。此外研究表明巨噬细胞在维持子宫局部微环境稳态中发挥重要作用[15]，其根据环境刺激有选择的极化为经典活化型（M1型）和替代活化型（M2型）两种表型，M1型巨噬细胞在月经期发挥其清除组织碎片和生成促炎细胞因子的作用，从而加速子宫内膜的破裂和脱落，相反M2型巨噬细胞分泌抗炎细胞因子和促进血管生成因子，参与经期后子宫内膜的修复过程，其数量与子宫内膜增厚进展呈正相关[16-17]；因此探寻NLRP3炎症小体是否参与虚寒证大鼠子宫病理损伤以及如何介导巨噬细胞极化水平的生物学机制是探究子宫局部发生血管损伤、炎症反应与病理水肿的潜在研究靶点，文章基于此开展实验研究，为深化JGWJD的临床应用提供实验依据。
1 材料 1.1 动物SPF级雌性SD大鼠60只，鼠龄8周，体质量（190~250 g），购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证编号：SCXK（京）2020-0004，实验动物使用许可证号：SYXK（冀）2020-007。动物实验方案经华北理工大学实验动物伦理委员会批准，实验动物伦理审批号：LX2021122。饲养条件：恒温（22±2）℃、恒湿（50±10）%、自由饮食饮水。适应性饲养2周，连续观察3个动情周期，排除动情周期紊乱者。
1.2 药品与试剂 1.2.1 JGWJD组成：吴茱萸9 g，当归6 g，白芍6 g，川芎6 g，人参6 g，桂皮6 g，阿胶6 g，牡丹皮6 g，生姜6 g，甘草6 g，半夏6 g，麦冬9 g。购于北京同仁堂药店。采用传统煎煮方法，人参单煎，阿胶烊化，其余药物加水提前先浸泡2 h，随后煮沸，文火煎煮60 min，滤出药液，此为一煎，药渣加水再煎40 min，滤出二煎药液，合并两次滤液及人参煎液加入烊化的阿胶，浓缩后置于4 ℃冰箱备用。
1.2.2 主要试剂异氟烷（深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司，货号：R510-22-16）；苏木素染液、伊红染色液（珠海贝索生物技术有限公司，货号：719051、C240404）；4%多聚甲醛组织固定液、戊二醛固定液；磷酸盐缓冲液（PBS）；抗荧光衰减封片剂（含DAPT）；5×蛋白上样缓冲液；高效RIPA裂解液；白细胞介素-1β（IL-1β）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（爱博泰克生物技术有限公司，货号RK00009）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（爱博泰克生物技术有限公司，货号RK05265）；白细胞介素-10（IL-10）ELISA试剂盒（爱博泰克生物技术有限公司，货号RM17825）；IL-1β抗体（公司名称：Senta cruz，货号：SC-515598）；白细胞介素-6（IL-6）抗体（公司名称：Report，货号：RA1028）；转化生长因子-β（TGF-β）抗体（公司名称：Arigo，货号：ARG56429）；TNF-α抗体（公司名称：Gene Tex，货号：GTX110520）；诱导型一氧化氮合酶（iNOS）抗体（公司名称：Arigo，货号：ARG56509）；IL-10抗体（公司名称：华安，货号：HA722032）；精氨酸酶-1（Arg-1）抗体（公司名称：Arigo，货号：ARG66822）；NLRP3抗体（公司名称：Report，货号：RA1075）；caspase-1抗体（公司名称：Senta cruz，货号：SC-56036）；微管蛋白（tubulin）抗体（公司名称：Arigo，货号：ARG54082）；二抗（公司名称：Report，货号：S1001-100 S1002-100）。
1.3 主要仪器与设备小动物超声波诊断仪[瑞孚迪生物医学（上海）有限公司，型号：Vega]；激光散斑血流成像系统（深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司，型号：RFLSI ZW）；显微镜（日本OLYMPUS公司，型号：BX53）；TP1020型组织脱水机（德国LEICA）；JK-FEC-6L型生物组织包埋机（上海精学科学仪器有限公司）；RM2245型组织切片机（德国LEICA）；OH6 9243B5 III型电热恒温鼓风干燥箱（美国赛洛捷克公司）；JK-TBP-3A型生物组织摊片机（上海精学科学仪器有限公司）；LM50R型低温组织研磨机（中国POWTEQ）；吸入式气体麻醉机（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；低温高速冷冻离心机（上海利鑫坚离心机有限公司，型号：L-88R）；酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司，型号：Spectra Max M2]；电泳仪/电转仪（北京君意东方电泳设备有限公司，型号：JY600E）。
2 方法 2.1 模型制备采用冰箱冷冻+冰水浴浸泡法制备模型。具体造模方法如下：将待造模大鼠分别放入规格为50 cm×35 cm×20 cm的饲养笼中，每5只一笼。在笼中加入0~1 ℃冰水混合物，液面高度平齐大鼠下腹部，放入4 ℃冰箱中，每次20 min，连续进行28 d。模型组大鼠连续3个动情周期紊乱，并表现出精神不振，喜扎堆，耳缘静脉、舌及四肢颜色紫黯、毛色晦暗毛发粗糙，大便不成形，提示模型构建成功[18]。
2.2 分组与给药按照随机数字表法分为对照组（Control组）、模型组（Model组）、JGWJD高剂量组（JGWJD-H组）、JGWJD中剂量组（JGWJD-M组）、JGWJD低剂量组（JGWJD-L组），每组12只。Control组大鼠常规饲养生理盐水灌胃。JGWJD各剂量组自造模第1天开始分别给予高、中、低剂量金匮温经汤灌胃给药，连续28 d，每日1次，参考《药理实验方法学》中“动物与人体体表面积等效剂量比值表”，进行灌胃剂量折算，成人（60 kg）与大鼠的折算系数为6.3，临床成人日用量为78 g，换算成大鼠的等效剂量为78 g/60 kg×6.3≈8.2 g/（kg·d）。此剂量设定为中剂量，高、低剂量分别为其2倍和0.5倍，故3组高、中、低剂量分别以16.4、8.2、4.1 g/（kg·d），Control组与Model组每日给予等体积蒸馏水灌胃。
2.3 取材造模及灌胃结束后，择动情间期，采用吸入性麻醉后打开腹腔，用一次性采血管收集腹主动脉血，静止2 h后离心机设置3 000 r/min，4 ℃，15 min，离心半径15.8 cm，机器运行结束后取上清冻于-80 ℃冰箱备检。随后用手术剪迅速取出子宫，并剔除附着的脂肪、小血管及其他腹膜组织（全程在冰盘上行无菌操作），修剪完毕后分离两侧子宫，左侧放于4%多聚甲醛溶液中进行固定用于蜡块包埋，右侧冻存于-80 ℃冰箱中备检。
2.4 指标检测于大鼠造模给药全程动态监测其一般形态、动情周期情况。
2.4.1 B超与激光散斑成像系统检测给药结束后给予各组大鼠吸入性麻醉，腹部脱毛后将大鼠置于小动物超声台采集区，设置探头采集面积覆盖大鼠盆腔，采集B超，并在程序上观测其子宫超声情况。激光血流成像系统在大鼠吸入性麻醉后置于血流检测探头下，调节探头置于大鼠脚部及腹部，分别监测子宫表面局部血流灌注量，随机采集3个区域血流量分析统计学数据。
2.4.2 大鼠血清ELISA检测大鼠麻醉后进行腹主动脉采血，凝血管室温静置2 h后，离心机设置3 000 r/min，4 ℃，离心15 min，离心半径为15.8 cm，结束后收集上清，按照ELISA试剂盒说明书操作，检测各组大鼠血清中IL-1β、IL-10、TNF-α及各项生殖激素含量。
2.4.3 形态学检测苏木精-伊红（HE）染色法：麻醉处死大鼠后，摘取新鲜子宫组织于多聚甲醛中固定72 h以上，经流水过夜及梯度脱水后行石蜡包埋。将石蜡切块采用切片机切成4 μm厚的组织切片，于43 ℃的摊片机中展开后置于载玻片上，随后进行HE染色。
电镜超微结构分析：另取一部分新鲜大鼠子宫组织，置于预冷的戊二醛固定液中，将组织修成1 mm3小块，继续固定后，用1%锇酸后固定，随后经梯度乙醇脱水，环氧树脂渗透包埋，制备超薄切片，经醋酸铀和柠檬酸铅染色后，于透射电子显微镜下观察其形态学变化。
2.4.4 免疫荧光染色检测iNOS与Arg-1的分布与表达大鼠子宫组织经固定、脱水、石蜡包埋后，制备4 μm切片。切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，置于柠檬酸钠缓冲液中进行高压抗原修复，随后置于室温冷却后取出玻片，用磷酸盐缓冲液（PBS）缓冲液洗涤3次，每次5 min，随后滴加一抗4 ℃孵育过夜，第2天回收一抗，PBS洗涤3次后滴加荧光二抗，37 ℃避光孵育1 h，DAPI复染，抗淬灭剂封片，置于荧光显微镜观察。
2.4.5 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测子宫组织中NLRP3、caspase-1、iNOS、IL-1β、TNF-α、IL-6、TGF-β、Arg-1、IL-10蛋白表达于-80 ℃冰箱中取出大鼠子宫组织，预冷PBS清洗后按照每100 mg加入100 μL的RIPA裂解液和1 μL的蛋白酶抑制剂，充分匀浆冰上裂解20 min，设置离心机4 ℃，离心半径为15.8 cm，12 700 r/min，离心30 min，收集上清。采用二喹啉甲酸（BCA）试剂盒测定蛋白浓度并计算蛋白样品与上样缓冲液混合，随后置于金属浴中煮25 min。将样本进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，随后用湿转法将蛋白转至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭12 h，滴加NLRP3、caspase-1、iNOS、IL-1β、TNF-α、IL-6、TGF-β、Arg-1、IL-10一抗蛋白（浓度均为1∶1 000），Tubulin内参抗体（浓度1∶10 000），4 ℃过夜，次日回收一抗，Tris缓冲盐溶液（TBST）洗涤3次，每次10 min，随后加入二抗室温摇床封闭1 h，随后TBST清洗3次后，滴加显影液于机器上进行曝光拍照。将Tubulin作为内参，使用ImageJ进行定量分析。
2.5 统计学方法实验数据采用SPSS23.0统计软件分析，结果以均数±标准差（x±s）表示，数据服从正态分布，多组间比较使用单因素方差（ANOVA）分析，两两比较若方差齐时采用LSD检验，方差不齐则采用Tamhane’s T2检验，结果以P＜0.05为差异有统计学意义。
3 实验结果 3.1 JGWJD对各组大鼠一般情况的影响Control组大鼠活泼好动，毛发柔顺有光泽，进食饮水量正常，四肢爪甲、耳缘舌色红润。Model组大鼠毛发晦暗杂乱，饮食进水均有所减少，疲倦萎靡，四肢爪甲、耳缘及舌体颜色紫暗。JGWJD各剂量组以上情况均有好转，尤以JGWJD-H组改善最为明显。
3.2 JGWJD对各组大鼠动情周期的影响阴道涂片结果显示，Control组大鼠动情周期比较固定，有节律性；与Control组相比，Model组大鼠动情周期、动情间期延长，动情期缩短，差异具有统计学意义（P＜0.05），与Model组相比，JGWJD各剂量组给药干预后动情周期、动情间期缩短，其中JGWJD-H、JGWJD-M两组效果较好，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表 1。
| d | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | 动物数 | 动情周期 | 动情间期 | 动情期 | 动情后期 | ||||||||||||||||||||||||
| Control组 | 12 | 4.83±0.94 | 1.79±0.97 | 1.46±0.81 | 1.74±0.64 | ||||||||||||||||||||||||
| Model组 | 12 | 6.52±2.43* | 2.68±1.26* | 0.91±0.68* | 2.57±1.02 | ||||||||||||||||||||||||
| JGWJD-H组 | 12 | 5.04±1.67# | 1.52±0.91# | 1.34±0.84 | 1.95±0.98 | ||||||||||||||||||||||||
| JGWJD-M组 | 12 | 5.07±2.04# | 1.61±0.64# | 1.27±0.58 | 2.07±0.74 | ||||||||||||||||||||||||
| JGWJD-L组 | 12 | 5.47±2.55 | 1.82±0.76# | 1.19±0.96 | 2.21±1.03 | ||||||||||||||||||||||||
| 注：与Control组比较，*P＜0.05；与Model组比较，#P＜0.05。 | |||||||||||||||||||||||||||||
激光散斑血流成像系统采集各组大鼠脚部及子宫表面血液灌注情况结果显示，Control组大鼠脚部及子宫表面血液供应充足，血管清晰可见，微循环良好；与Control组相比，Model组大鼠脚部及子宫表面微循环血液灌注降低，血管血流运行障碍（P＜0.01）；与Model组相比，JGWJD各剂量组脚部及子宫表面微循环血液灌注有所恢复，供血功能改善高、中剂量组效果较好（P＜0.01）。提示JGWJD能够改善虚寒证模型大鼠血液循环障碍，增加局部血液灌注量。见图 1。
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| 注：A-E，脚部组；F-J，子宫组；A、F，Control组；B、G，Model组；C、H，JGWJD-H组；D、I，JGWJD-M组；E、J，JGWJD-L组。与Control组比较，**P＜0.01；与Model组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。 图 1 JGWJD对大鼠脚部及子宫表面血液灌注的影响（x±s） |
组大鼠子宫区域内部结构层次清晰，回声均匀，子宫包膜光滑，未见异常回声；与Control组相比，Model组在子宫颈与子宫体区域可见不规则形低回声或无回声区，此为游离液体积聚，子宫体肿胀变形，边缘模糊，内膜受压变薄；给药干预后各组上述情况得到明显改善，JGWJD-M、JGWJD-L两组暗液区变小，JGWJD-H组无低回声反应，子宫体形态恢复，脏器形状规整，大小及相对位置清晰可见，见图 2。
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| 注：图A，Control组；图B，Model组；图C，JGWJD-H组；图D，JGWJD-M组；图E，JGWJD-L组；红色方框，子宫组织横截面；蓝色箭头，子宫体；黄色箭头，回声异常暗液区。 图 2 JGWJD对大鼠子宫超声结构的影响 |
图中“Y”字型部位为大鼠完整离体子宫组织，结果显示，Control组大鼠子宫红润光滑，整体形态完整，无肿胀；与Control组相比，Model组子宫组织双侧有明显组织液渗出，子宫体肿胀变形，管壁变薄；与Model组相比，JGWJD各剂量组水肿情况均有改善，组织形态不同程度得以恢复，JGWJD-H组效果最佳，见图 3。
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| 注：图A，Control组；图B，Model组；图C，JGWJD-H组；图D，JGWJD-M组；图E，JGWJD-L组。 图 3 代表性大鼠子宫大体组织形态 |
结果显示，与Control组相比，Model组血清IL-1β、TNF-α明显升高（P＜0.01），IL-10含量显著降低（P＜0.01）；与Model组相比，JGWJD-H和JGWJD-M、组IL-1β、TNF-α含量明显下降（P＜0.01），而IL-10显著升高（P＜0.01），提示JGWJD能够改善虚寒证模型大鼠炎症反应。见表 2。
| pg/mL | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | 动物数 | IL-1β | IL-10 | TNF-α | |||||||||||||||||||||||||
| Control组 | 12 | 209.58±13.49 | 135.31±9.76 | 24.45±2.34 | |||||||||||||||||||||||||
| Model组 | 12 | 364.06±16.55** | 38.16±16.29** | 92.20±3.04** | |||||||||||||||||||||||||
| JGWJD-H组 | 12 | 239.13±16.92## | 121.45±17.05## | 34.11±1.65## | |||||||||||||||||||||||||
| JGWJD-M组 | 12 | 268.09±12.58## | 84.24±9.92## | 78.06±2.81## | |||||||||||||||||||||||||
| JGWJD-L组 | 12 | 320.57±13.87## | 64.59±15.58## | 89.95±2.49# | |||||||||||||||||||||||||
| 注：与Control组比较，**P＜0.01；与Model组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。 | |||||||||||||||||||||||||||||
血清各项激素检测结果显示，与Control组相比，Model组大鼠血清中雌二醇（E2）、孕激素（P）、促黄体生成素（LH）、促卵泡刺激素（FSH）含量均明显下降（P＜0.05）；而JGWJD-H、JGWJD-M、JGWJD-L组E2、P、LH及FSH含量均有不同程度的上调，其中高、中剂量组效果较好，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表 3。
| 组别 | 动物数 | E2(pg/mL) | P(ng/mL) | LH(mIU/mL) | FSH(mIU/mL) |
| Control组 | 12 | 76.34±11.23 | 46.32±10.58 | 8.06±2.13 | 7.64±2.62 |
| Model组 | 12 | 52.32±15.29* | 30.16±12.39* | 4.25±3.16* | 3.95±1.18* |
| JGWJD-H组 | 12 | 66.31±20.91# | 41.12±18.26# | 6.56±3.64# | 5.67±1.95# |
| JGWJD-M组 | 12 | 62.95±22.18# | 40.95±16.18# | 6.15±3.15# | 5.25±1.57# |
| JGWJD-L组 | 12 | 54.26±24.56# | 39.26±13.46# | 5.09±3.05 | 4.56±1.64 |
| 注：与Control组比较，*P＜0.05；与Model组比较，#P＜0.05。 | |||||
HE染色结果显示，子宫组织结构由内到外依次为子宫腔、管腔上皮、子宫内膜基质层、子宫肌层和膜内层。Control组大鼠的子宫组织结构完整，各结构界限清晰，腺体正常排列整齐，管腔上皮无断裂，血管数目较多，内膜基质层较厚，未见炎性浸润；与Control组相比Model组大鼠子宫组织内膜结构被破坏、子宫腔肿胀并见大量中性粒细胞渗出、血块堆积，管腔上皮断裂残缺，子宫内膜基质层变薄，腺体稀疏且形态不规则，血管数目减少；与Model组相比，JGWJD各剂量组子宫腔均有变小，管腔上皮连续性较好，腺体及血管增加，子宫内膜基质层厚度恢复，整体形态尚可，JGWJD-H组恢复最佳，见图 4。
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| 注：图A~E，整体子宫组织图（标尺：200 μm，×40）；图F~J，局部子宫组织图（标尺：100 μm，×100）；图A、F，Control组；图B、G，Model组；图C、H，JGWJD-H组；图D、I，JGWJD-M组；图E、J，JGWJD-L组。 图 4 JGWJD对大鼠子宫病理组织形态学的影响 |
透射电镜采集结果显示，与Control组相比，Model组子宫组织表面微绒毛数量稀疏，排列杂乱，糖萼减少甚至消失，子宫内膜基质密度下降，上皮细胞重度水肿，核不规则，细胞基质中空泡脂滴较多，单核炎性细胞浸润明显，内质网排列无序伴有扩张，线粒体肿胀；与Model组相比，JGWJD各剂量组微绒毛数量有所恢复，糖萼增多，细胞连接紧密度增加，线粒体形态不同程度恢复，JGWJD-H组效果最佳，提示JGWJD可以治疗寒冷刺激带来的子宫内部结构损伤，见图 5。
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| 注：图A，Control组；图B，Model组；图C，JGWJD-H组；图D，JGWJD-M组；图E，JGWJD-L组；O示脂滴，N示细胞核，蓝色箭头示微绒毛，黄色箭头示线粒体。 图 5 JGWJD对大鼠子宫组织超微结构的影响（透射电镜，标尺：5 μm，×6 000） |
免疫组织荧光染色结果显示，与Control组相比，Model组子宫组织切片中定位在胞浆的M1型巨噬细胞标记物相关标记物iNOS表达增加，同时M2型巨噬细胞相关标记物标记物Arg-1表达降低（P＜0.01），提示子宫促炎与抗炎状态失衡；与Model组相比，JGWJD各组Arg-1表达增高，高剂量组效果最好（P＜0.01），iNOS表达降低（P＜0.05），见图 6。
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| 注：A，Control组；B，Model组；C，JGWJD-H组；D，JGWJD-M组；E，JGWJD-L组；DAPI为蓝色细胞核复染；Merge为各通道荧光叠加图。与Control组比较，**P＜0.01；与Model组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。 图 6 JGWJD对大鼠子宫切片M1/M2巨噬细胞标记物表达水平的影响（x±s，n=3） |
Western blot检测各组大鼠子宫组织NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表达结果显示，与Control组相比，Model组子宫中NLRP3、caspase-1、IL-1β表达水平显著升高（P＜0.01），给药干预后各剂量组NLRP3、caspase-1、IL-1β均呈下降趋势，其中JGWJD-H组效果最佳（P＜0.01），见图 7。
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| 注：与Control组比较，**P＜0.01；与Model组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。 图 7 各组大鼠子宫组织NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表达结果（x±s，n=3） |
Western blot检测各组大鼠子宫M1型巨噬细胞标记物iNOS与促炎因子IL-6、TNF-α蛋白表达结果显示，与Control组相比，Model组子宫中iNOS、IL-6、TNF-α表达水平显著升高（P＜0.01）；与Model组相比，JGWJD-H组能够显著降低iNOS、IL-6、TNF-α的表达水平（P＜0.01），JGWJD-M组能明显抑制IL-6、TNF-α表达（P＜0.01），对iNOS也有明显改善（P＜0.05）；JGWJD-L组明显下调TNF-α蛋白表达（P＜0.01），对IL-6也有明显改善（P＜0.05），同样能够抑制iNOS表达但无统计学意义，见图 8。
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| 注：与Control组比较，**P＜0.01；与Model组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。 图 8 各组大鼠子宫组织iNOS、IL-6、TNF-α蛋白表达结果（x±s，n=3） |
Western blot检测各组大鼠子宫M2型巨噬细胞标记物Arg-1、抗炎因子IL-10、TGF-β蛋白表达结果显示，与Control组相比，Model组子宫中Arg-1、IL-10、TGF-β表达水平显著降低（P＜0.01）；与Model组相比，JGWJD-H组能够显著升高Arg-1、IL-10、TGF-β的表达水平（P＜0.01），JGWJD-M组能明显上调Arg-1、IL-10表达（P＜0.01），对TGF-β也有明显改善（P＜0.05）；JGWJD-L组明显下调IL-10蛋白表达（P＜0.05），对Arg-1、IL-10也有作用，但无统计学意义。
综上，提示JGWJD能够通过拮抗NLRP3炎症小体的激活，降低其下游效应蛋白（caspase-1）及促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表达。同时调控与巨噬细胞极化水平相关的蛋白表达谱，表现为抑制M1型巨噬细胞标志蛋白（iNOS）及其相关促炎因子，并促进M2型巨噬细胞标志蛋白（Arg-1）及其相关抗炎因子（IL-10，TGF-β）的表达。这些结果共同提示，JGWJD可能通过调节子宫局部免疫微环境，抑制促炎状态并促进修复状态，从而发挥治疗作用。见图 9。
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| 注：与Control组比较，**P＜0.01；与Model组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。 图 9 各组大鼠子宫组织Arg-1、IL-10、TGF-β蛋白表达结果（x±s，n=3） |
月经是女性最具特征性的生理现象。月经来潮是雌孕激素撤退导致子宫内膜组织及血管结构改变的结果，在这个过程中伴随着内膜白细胞亚群的浸润、细胞外基质的降解、上皮细胞的凋亡和类似炎症反应的强烈局部变化。中医理论认为寒邪易与湿结，而寒湿纠缠不化困于下焦则进一步引发机体气机、寒凉内蕴、冲任失调，这是寒证易引发女性生殖系统炎症性反应的早期认识，现代研究证实，寒湿互结于盆腔，会引发局部炎症，使炎性因子表达升高，影响受孕；高海拔地区温度较低会导致体内炎性因子和C反应蛋白的合成从而增加炎症反应发生概率，课题组前期研究显示，寒冷刺激下引发生殖激素紊乱，子宫出现氧化应激状态，血流减少，盆腔微血管循环障碍，进而导致月经周期紊乱、子宫炎、子宫内膜异位症等妇科疾病[19-20]。
巨噬细胞是人体免疫屏障的重要组成部分，巨噬细胞极化与重组转化所体现的相互性与对立性正如同中医阴阳理论内涵，两者互根互用，对立统一，特定条件下相互转化的特点体现在巨噬细胞表型极化中相当于M2型巨噬细胞通过生成抗炎因子及抑炎功能发挥清除、吞噬体内致病因子的作用，体现其为“正气”驱赶“邪气”等致病因素，使机体恢复阴阳平衡的健康状态[21-22]。研究表明NLPR3炎症小体能够通过募集焦亡相关斑点蛋白从而促进caspase-1激活成为Cleaved-caspase-1，并且促进下游pro-IL-1β形成有活性的IL-1β因子释放，以此参与组织炎症反应和损伤的全过程[23-24]，另有实验证明炎症小体的激活与启动会影响巨噬细胞的活化水平[25-27]。如Li等[28]通过构建缺血性中风模型研究发现，通过抑制炎症小体的激活，巨噬细胞表型从M1切换到M2，从而减轻神经炎症反应并促进脑损伤的修复；SHANG等通过研究发现，炎症小体的激活及其相关蛋白生成增加会诱导M1型巨噬细胞的活化，这是特异性皮炎的潜在治疗靶点，通过给予紫外线处理的核黄素干预后其症状有效缓解[29]。
研究结果表明，虚寒证模型大鼠子宫中NLRP3表达水平显著增加，其效应蛋白caspase-1被激活表达显著增加并促进下游活性IL-1β的生成与释放，表明NLRP3炎症小体被激活参与了子宫局部损伤，同时IL-1β作为M1型巨噬细胞的下游炎症因子之一证实M1型巨噬细胞被活化，其内在机制是在寒冷刺激下大鼠子宫内M1型巨噬细胞极化增加，其标志物因子iNOS呈现高表达同时下游致炎因子如TNF-α、IL-6、IL-1β等因子分泌增加，此为局部炎症反应与水肿化生之源流，相对的M2型巨噬细胞数量减少，其标志物Arg-1相对低表达，其下游抗炎因子IL-10、TGF-β、IL-10等受到抑制，造成了虚寒证模型大鼠的子宫损伤，炎症小体在此过程中通过M1型巨噬细胞下游炎症因子生成从而促使上游分型向促炎型的巨噬细胞活化，拮抗抑炎型巨噬细胞活化参与疾病发展全过程。而给予JGWJD干预后炎症小体的激活被抑制，平衡了M1与M2巨噬细胞的极化水平，诱导增加了M2型巨噬细胞的表达与转化，并抑制M1型巨噬细胞极化，两者下游抗炎因子的表达上升同时促炎因子得以拮抗，从而促进子宫损伤的修复。提示金匮温经汤能够抑制NLRP3炎症小体，并调节巨噬细胞M1/M2极化平衡从而发挥治疗作用，但其内在生物学机制有待于进一步探索。
5 结论综上，提示金匮温经汤能够通过拮抗炎症小体的启动与激活，降低其下游效应蛋白与炎症因子的生成与释放，同时调节子宫组织内与巨噬细胞极化相关的蛋白平衡，抑制M1型相关促炎因子表达，促进M2型相关抗炎因子表达，从而发挥修复子宫损伤的作用。
研究尚存一定局限性，目前检测的iNOS和Arg-1表达变化主要反映其在子宫组织中的整体水平，由于未进行与巨噬细胞标记物（如CD68）的共定位染色，尚不能直接证实其特异性定位于巨噬细胞亚群。此外，对NLRP3炎症小体的上游调控及下游细胞焦亡机制探讨仍有不足。未来需通过流式细胞术或免疫荧光共定位等技术进一步明确巨噬细胞表型变化，并深入解析相关信号通路。
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